辣椒素通过上调MTSS1 表达抑制结肠癌细胞侵袭、迁移的实验研究

黄 虹黄 蝶王瑞杰余壮明

(1.海南医学院第一附属医院介入血管外科,海口 570102;2.海南医学院第一附属医院血液透析科,海口 570102;3.海南医学院第一附属医院眼科,海口 570102;4.海南医学院第一附属医院普通外科,海口 570102)

结肠癌作为消化道常见肿瘤,在中国其发病率仅次于肺癌和胃癌,位于第3,早期症状不明显,与肠炎等良性疾病易混淆,发现时已至晚期,且发病趋于年轻化,危害严重[1]。 目前治疗结肠癌常见药物为奥沙利铂,但该药物对血液、神经系统会产生毒性,不能长期使用[2],因此,寻找安全有效且毒性副作用均低的药物对于治疗尤为重要。 辣椒素在临床上应用有数十年,是辣椒中具有辛辣刺激性的复合物,具有镇痛、抗炎、抗肿瘤、抗肥胖、保护心脏等多项作用,且对肿瘤的作用越来越受到重视[3]。辣椒素作为潜在的新型治疗药物在人类癌症中有一定应用,具有抗增殖、诱导细胞凋亡和自噬、抗血管生成和抗转移等作用[4]。 肿瘤转移抑制因子1(metastasis suppressor1,MTSS1)作为细胞间连接,参与肌动蛋白介导的细胞核形成与细胞间微丝分支稳定性,可降低肿瘤的迁移、浸润能力[5]。 在乳腺癌中研究发现,辣椒素可以上调MTSS1、下调基质金属蛋白酶(matrix metallo proteinases, MMP)-2、MMP-9,实现对肿瘤的抑制[6],但在结肠癌中尚无发现相关研究。 因此, 本文以人结肠癌细胞HCT116 作为研究对象,探讨辣椒素对细胞侵袭、迁移的影响,并初步探讨其机制,为临床上辣椒素对结肠癌的治疗提供一定参考依据。

1 材料和方法

1.1 细胞

人结肠癌细胞HCT116 购自中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库,目录号:TCHu99。

1.2 主要试剂与仪器

辣椒素购自美国Sigma 公司,货号:M1022-50M;引物由上海吉凯基因技术有限公司合成;LipofectamineTM2000 购自美国invitrogen 公司,货号:11668019;CCK8 试剂盒购自广州佳研生物科技有限公司,货号:MA0218-15;结晶紫染色液购自上海碧云天公司,货号:C0121;一抗辣椒素受体(transient receptor potential vanilloid 1,TRPV1)、MTSS1、MMP-2、MMP-9 购自英国abcam 公司,货号分别为:ab6166、ab204127、ab92536、ab228402。 Transwell 小 室 购 自Costar 公司,型号:3460;全自动酶标仪购自美国Bio-Rad 公司,型号:Model 680;蛋白凝胶成像仪购自上海Tanon 公司,型号:Tanon2500。

1.3 实验方法

1.3.1 细胞培养

HCT116 细胞置于含10%胎牛血清的DMEM 培养液中,37℃、5% CO2恒温箱中培养,2 ～3 d 更换1 次培养液,细胞密度长至90%时传代,细胞生长至对数期实验。

1.3.2 siRNA 引物设计

Whitehead siRNA Selection Web Server 在线设计,MTSS1 siRNA:5’-GGTTCTGATTACAGCTGGT-3’、对照siRNA:5’-UACAGACCCCUCGAUCGGUTT-3’。

1.3.3 细胞分组

HCT116 细胞参考文献[7]处理并进行预实验。实验1:10、25、50、100 μmol/L 辣椒素组(10、25、50、100 μmol/L capsaicin group)分别加入终浓度为10、25、50、100 μmol/L 辣椒素,对照组(control group)不添加辣椒素,37℃、5% CO2恒温箱中培养24 h;实验2:对照组(control group)、100 μmol/L 辣椒素组(100 μmol/L capsaicin group)、100 μmol/L 辣椒素+对照siRNA 组(100 μmol/L capsaicin+control siRNA group)、100 μmol/L 辣椒素+MTSS1 siRNA 组(100 μmol/L capsaicin+MTSS1 siRNA group),100 μmol/L

辣椒素组添加终浓度为100 μmol/L 辣椒素;100 μmol/L 辣椒素+对照siRNA 组、100 μmol/L 辣椒素+MTSS1 siRNA 组在100 μmol/L 辣椒素组的基础上分别添加终浓度为50 nmol/L 对照siRNA、MTSS1 siRNA(参照LipofectamineTM2000 说明书转染),转染4 h 更换为终浓度为100 μmol/L 辣椒素培养液,对照组正常培养24 h。 CCK8 检测细胞增殖情况;Transwell 检测细胞侵袭情况;划痕实验检测细胞迁移情况;蛋白质免疫印迹(Western blot)检测细胞中TRPV1、MTSS1、MMP-2、MMP-9 蛋白水平。

1.3.4 CCK8 检测细胞增殖情况

各组细胞在96 孔板中处理24 h,加入CCK8 继续培养2 h,全自动酶标仪测定450 nm 波长下各孔吸光度(optical density,OD),增殖抑制率=(对照孔OD450-实验孔OD450)/对照组OD450×100%,6 个重复孔。

1.3.5 Transwell 检测细胞侵袭情况

各组细胞在24 孔板中处理24 h,收集细胞,无胎牛血清培养液稀释成每毫升1×104个的单细胞悬液,Transwell 小室经基质胶上下包被后放入24 孔板中,小室下层加500 μL 完全培养液,上层加500 μL单细胞悬液,置于37℃、5% CO2培养箱中培养48 h,结晶紫染色后显微镜拍照并计数。1.3.6 划痕实验检测细胞迁移情况

各组细胞在6 孔板中处理24 h,去培养液,PBS清洗细胞,划痕后立即拍照,添加10%胎牛血清DMEM 培养液,培养48 h 拍照,Image J 检测细胞迁移情况。 迁移百分比=(0 h 划痕面积-48 h 划痕面积)/0 h 划痕面积×100%。

1.3.7 Western blot 检测细胞中TRPV1、MTSS1、MMP-2、MMP-9 蛋白表达情况

各组细胞在6 孔板中处理24 h,添加蛋白裂解液冰上裂解细胞10 min,10000 r/min 4℃离心20 min,上清为总蛋白,BCA 蛋白试剂盒测定总蛋白浓度。 每孔上样20 μg,聚丙烯酰胺凝胶电泳浓缩胶、分离胶分离蛋白,NC 膜转膜后,5%脱脂奶粉室温封闭2 h,加对应一抗TRPV1、MTSS1、MMP-2、MMP-9,4℃孵育过夜,洗涤后添加对应二抗常温下孵育2 h。DAB 显色试剂盒显色,蛋白凝胶成像仪拍照和定量分析。

1.4 统计学方法

采用SPSS 20.0 软件对数据进行统计分析,计量资料以平均数±标准差( ¯x±s)表示,多组间比较采用单因素方差分析,进一步两两比较行SNK-q检验,P＜0.05 表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 辣椒素对细胞增殖的影响

与对照组相比,25、50、100 μmol/L 辣椒素组细胞增殖抑制率升高(P＜0.05)。 见表1。

2.2 辣椒素对细胞侵袭的影响

与对照组相比,10、25、50、100 μmol/L 辣椒素组细胞侵袭数量降低(P＜0.05)。 见表1、图1。

图1 不同浓度辣椒素处理细胞侵袭情况Figure 1 Invasion of cells at different concentrations of capsaicin concentrations of capsaicin

表1 不同浓度辣椒素处理细胞增殖抑制率、侵袭数量、迁移百分比的比较(n=6)Table 1 Comparison of cell proliferation inhibition rate, invasion number, and migration percentage at different

2.3 辣椒素对细胞迁移的影响

与对照组相比,10、25、50、100 μmol/L 辣椒素组细胞迁移百分比降低(P＜0.05)。 见表1、图2。

图2 不同浓度辣椒素处理细胞迁移情况Figure 2 Migration of cells at different concentrations of capsaicin

2.4 辣椒素对细胞中TRPV1、MTSS1、MMP-2、MMP-9 蛋白水平的影响

与对照组相比,10、25、50、100 μmol/L 辣椒素组细胞中TRPV1、MTSS1 蛋白水平升高,MMP-2、MMP-9 蛋白水平降低(P＜0.05)。 见表2、图3。

图3 不同浓度辣椒素处理细胞中TRPV1、MTSS1、MMP-2、MMP-9 蛋白水平情况Figure 3 Protein levels of TRPV1, MTSS1, MMP-2 and MMP-9 in cells with different concentrations of capsaicin

表2 不同浓度辣椒素处理细胞中TRPV1、MTSS1、MMP-2、MMP-9 蛋白水平比较(n=6)Table 2 Comparison of TRPV1, MTSS1, MMP-2 and MMP-9 protein levels in cells with different concentrations of capsaicin

2.5 干扰MTSS1 对辣椒素处理细胞侵袭的影响

与对照组相比,100 μmol/L 辣椒素组、100 μmol/L 辣椒素+对照siRNA 组、100 μmol/L 辣椒素+MTSS1 siRNA 组细胞侵袭数量降低(P＜0.05);分别与100 μmol/L 辣椒素组、100 μmol/L 辣椒素+对照siRNA 组相比,100 μmol/L 辣椒素+MTSS1 siRNA组细胞侵袭数量升高(P＜0.05)。 见图4、表3。

图4 干扰MTSS1 后辣椒素处理细胞侵袭的情况Figure 4 Invasion of capsaicin-treated cells by interference with MTSS1

2.6 干扰MTSS1 对辣椒素处理细胞迁移的影响

与对照组相比,100 μmol/L 辣椒素组、100 μmol/L 辣椒素+对照siRNA 组、100 μmol/L 辣椒素+MTSS1 siRNA 组细胞迁移百分比降低(P＜0.05);分别与100 μmol/L 辣椒素组、100 μmol/L 辣椒素+对照siRNA组相比,100 μmol/L 辣椒素+MTSS1 siRNA 组细胞迁移百分比升高(P＜0.05)。 见图5、表3。

表3 干扰MTSS1 后辣椒素处理细胞侵袭数量、迁移百分比的比较(n=6)Table 3 Comparison of the invasion and migration of capsaicin-treated cells by interference with MTSS1

图5 干扰MTSS1 后辣椒素处理细胞迁移情况Figure 5 Migration of capsaicin-treated cells by interference with MTSS1

2.7 干扰MTSS1 对辣椒素处理细胞中MTSS1、MMP-2、MMP-9 蛋白水平的影响

与对照组相比,100 μmol/L 辣椒素组、100 μmol/L 辣椒素+对照siRNA 组、100 μmol/L 辣椒素+MTSS1 siRNA 组细胞中MTSS1 蛋白水平升高,MMP-2、MMP-9 蛋白水平降低(P＜0.05);分别与100 μmol/L 辣椒素组、100 μmol/L 辣椒素+对照siRNA 组相比,100 μmol/L 辣椒素+MTSS1 siRNA组细胞中MTSS1 蛋白水平降低,MMP-2、MMP-9 蛋白水平升高(P＜0.05)。 见表4、图6。

表4 干扰MTSS1 后辣椒素处理细胞中MTSS1、MMP-2、MMP-9 蛋白水平比较(n=6)Table 4 Comparison of MTSS1, MMP-2 and MMP-9 protein levels in capsaicin-treated cells by interference with MTSS1

图6 干扰MTSS1 后辣椒素处理细胞中MTSS1、MMP-2、MMP-9 蛋白水平情况Figure 6 Protein levels of MTSS1, MMP-2 and MMP-9 in capsaicin-treated cells by interference with MTSS1

3 讨论

结肠癌细胞侵袭、迁移会造成远处肺、骨、肝转移,侵袭、转移是肿瘤患者死亡的最主要原因[8],因此,发现一种可以有效抑制结肠癌侵袭、转移且副作用小物质对于结肠癌的治疗意义重大。 辣椒素作为辣椒皮质中生物碱,通过TRPV1 或其他途径参与抗肿瘤作用,是抗肿瘤潜在药物,具有广阔应用前景[9-10],但作用机制复杂,目前具体机制尚不清楚,尚需进一步研究。 研究发现,辣椒素可以抑制结肠癌细胞增殖、侵袭、迁移,提示辣椒素对结肠癌具有抑制侵袭、迁移作用,实现对结肠癌的保护,但尚需研究机制。

辣椒素是唯一一种TRPV1 的天然激活剂,在结直肠的黏膜层、黏膜下层、肌肉层、肌肉神经丛中均发现TRPV1 的表达,可调节肠道运动、分泌、循环等功能[11-12];在结肠癌中表达水平低于远处正常组织,可能参与结直肠癌的发生发展[13]。 研究发现,结肠癌细胞中添加辣椒素可以增加TRPV1 的蛋白水平,提示辣椒素激活TRPV1,实现对结肠癌的影响。 MTSS1 作为细胞骨架肌动蛋白衔接蛋白,作为支架蛋白参与板状伪足形成过程,发挥肿瘤抑制作用[14],在正常组织中均有表达,但在结直肠癌、结肠癌中低表达甚至不表达,被认为是一种肿瘤转移抑制型基因[15-16]。 MMPs 几乎可以降解细胞外基质中各种蛋白成分,可破坏肿瘤细胞侵袭的组织学屏障,从而促进肿瘤转移[17];在众多MMPs 中,MMP-2、MMP-9 参与血管基底膜降解过程,与肿瘤侵袭、迁移关系密切[18-19]。 进一步研究发现,过表达MTSS1 可以降低MMP-2、MMP-9 的表达,在胶质瘤中MTSS1 调控MMP-2、MMP-9 发挥作用[20]。 本研究发现,添加辣椒素后可以促进MTSS1 的表达,从而降低MMP-2、MMP-9 蛋白表达,抑制结肠癌侵袭、迁移过程。 而添加MTSS1 抑制剂后,细胞侵袭、迁移过程增强,细胞中MMP-2、MMP-9 蛋白表达升高;MTSS1 抑制剂可以减弱辣椒素对细胞侵袭、迁移的抑制过程。 提示辣椒素通过促进MTSS1 表达,抑制MMP-2、MMP-9 蛋白表达,实现对侵袭、迁移的抑制。

综上所述,辣椒素通过上调MTSS1 表达从而抑制结肠癌细胞侵袭、迁移过程,实现对结肠癌的保护,为临床上结肠癌的治疗提供一定参考依据。 但辣椒素不同浓度对肿瘤的影响差异极大,研究辣椒素治疗结肠癌的最佳浓度是后续探究重点。