血清let- 7 a水平对喉癌手术患者预后的预测价值

陈皓，张珂，李红娟

安阳市第六人民医院耳鼻喉科，河南 安阳 455000

喉癌是指发生于喉部上皮的恶性肿瘤，其早期临床表现为声音沙哑、咽喉异物感、血痰等[1]。喉癌约占全身恶性肿瘤的8.0%，手术是喉癌直接而有效的治疗方法，虽然近年来手术联合放疗、化疗和生物治疗等综合治疗方法使喉癌患者的近期预后有所改善，但其远期生存率并未获得有效提高[2]。研究显示，喉癌手术患者的3年生存率为71.79%，5年生存率仅为57.69%，一旦出现颈部淋巴结转移，其生存率将会大大下降[3]。微小RNA（microRNA，miRNA）是一类内源性小分子非编码RNA，与肿瘤的发生和发展密切相关[4]。let-7a作为miRNA中的重要一员，可与原癌基因ras、高迁移率族蛋白A2、c-myc的3'末端非翻译区相结合，抑制靶基因的转录和翻译，从而抑制肿瘤生长、侵袭和转移等生物学过程[5]。研究发现，let-7a水平在肝癌、口腔癌和食管癌等恶性肿瘤组织中均显著降低[6-8]。也有研究显示，喉癌患者血清let-7a水平显著下调，且let-7a水平与淋巴结转移有关，表明let-7a有助于喉癌的早期诊断和术后病情监测[9]。但是有关血清let-7a水平对喉癌手术患者预后预测价值的研究鲜见报道。本研究通过分析85例喉癌手术患者的临床资料，旨在探讨血清let-7a水平对喉癌手术患者预后的预测价值，现报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选择2015年6月至2017年6月于安阳市第六人民医院接受手术治疗的喉癌患者。纳入标准：①经术后病理检查确诊为喉癌；②术前未接受放疗、化疗及免疫治疗；③随访3年或术后3年内因喉癌进展而死亡；④临床资料完整。排除标准：①合并其他恶性肿瘤；②具有风湿免疫相关疾病病史；③未按照医嘱正规治疗或因复发而再次手术。依据纳入和排除标准，本研究共纳入85例患者。其中，男48例，女37例；年龄35～80岁，平均（54.50±7.61）岁；根据第8版国际抗癌联盟（Union for International Cancer Control，UICC）TNM分期系统进行分期[10]：Ⅰ期25例，Ⅱ期37例，Ⅲ期16例，Ⅳ期7例。根据术后3年内是否死亡将患者分为死亡组（n=21）和生存组（n=64）。本研究经医院伦理委员会审批通过，所有患者均知情同意并签署知情同意书。

1.2 资料收集及let- 7 a水平检测

收集患者的性别、年龄、肿瘤类型、分化程度、T分期及TNM分期等临床资料。采用无RNA酶的离心管收集患者的血液样本5 ml，3000 r/min离心10 min，静置0.5～1.0 h待样本全部凝固。吸取1.5 ml上清液置于新的无RNA酶的离心管中，-80℃保存待检，所有标本均在2个月内完成检测。采用实时荧光定量聚合酶链反应（quantitative real-time polymerase chain reaction，qRT-PCR）检测血清let-7a水平。按照Trizol试剂盒（购自上海名劲生物科技有限公司）说明书提取总RNA，并采用Super-Script®Ⅲ试剂盒（购自北京智杰方远科技有限公司）将RNA反转录合成cDNA。采用qRT-PCR MasterMix试剂盒（购自北京百奥莱博科技有限公司）及SYBR GreenⅠ染料（购自厦门致善生物科技有限公司）进行qRT-PCR，检测血清let-7a水平。反应条件：95℃预变性30 s，95℃变性5 s，50℃复性15 s，75℃延伸30 s，共40个循环。以U6为内参基因，let-7a引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。反应结束后收集并整理实验数据，分析 Ct值，采用 2-ΔΔCt法计算 let-7a相对表达量。

1.3 统计学方法

采用SPSS 21.0软件对数据进行统计分析，符合正态分布的计量资料以均数±标准差（±s）表示，组间比较采用t检验；计数资料以例数和率（%）表示，组间比较采用χ2检验；采用Logistic回归模型进行多因素分析；采用受试者工作特征（receiver operating characteristic，ROC）曲线分析let-7a水平对喉癌手术患者预后的预测价值。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 喉癌手术患者预后影响因素的单因素分析

随访3年内，共21例（24.71%）患者死亡。死亡组和生存组患者的性别、年龄比较，差异均无统计学意义（P＞0.05）。死亡组和生存组患者的肿瘤类型、分化程度、T分期、TNM分期及let-7a水平比较，差异均有统计学意义（P＜0.05）。（表1）

表1 喉癌手术患者预后影响因素的单因素分析

2.2 喉癌手术患者预后影响因素的多因素Logistic回归分析

以单因素分析中差异有统计学意义的因素作为自变量，以喉癌手术患者预后作为因变量进行Logistic回归分析，结果显示，肿瘤类型、分化程度、T分期、TNM分期及let-7a水平均是喉癌手术患者预后的独立影响因素（P＜0.05）。（表2）

表2 喉癌手术患者预后影响因素的多因素Logistic回归分析（ n=85）

2.3 let- 7 a对喉癌手术患者预后的预测价值

ROC曲线分析结果显示，血清let-7a水平预测喉癌手术患者预后的曲线下面积为0.923，截断值为0.66，灵敏度为85.70%，特异度为84.40%。（图1）

图1 let- 7 a预测喉癌手术患者预后的ROC曲线

3 讨论

喉癌是咽喉部常见的恶性肿瘤，其早期可表现为声音嘶哑、喉部异物感、咯血等[11]。在中国，喉癌约占全身肿瘤的5%，约占头颈部肿瘤的20%[12]。全球统计资料表明，近年来喉癌的发病率呈大幅度上升趋势[13]。本研究对纳入的85例喉癌患者随访3年，其中21例患者死亡，死亡率为24.71%，提示喉癌患者术后的死亡风险较大。研究发现，淋巴结转移是喉癌患者术后生存的高危因素[14-15]。因此，寻找合适的标志物预测喉癌手术患者预后具有重要意义。

miRNA是一类长约22个核苷酸的非编码RNA，广泛存在于从病毒到人类的各种真核生物中。研究显示，人类大部分恶性肿瘤如胃癌、胰腺癌、结肠癌等均具有miRNA异常表型，miRNA在细胞的生长、分化、凋亡及肿瘤的发生、转移、耐药等过程中发挥着重要作用[16-18]。据报道，外周血miRNA水平具有肿瘤相关性及组织特异性，使miRNA作为恶性肿瘤早期诊断与预后判断的血清标志物成为可能[19]。let-7a是第二个被鉴定出的miRNA，是miRNA家族中研究最多且较为重要的成员之一。let-7a转录的抑癌miRNA与原癌基因Ras、c-myc的mRNA遵循碱基互补配对原则，从而抑制Ras、c-myc的表达，也可靶向抑制高迁移率族蛋白A2的表达，从而抑制肿瘤的侵袭和转移[20]。报道显示，在喉癌、肝癌、宫颈癌等诸多恶性肿瘤中均存在let-7a表达明显下调的现象。马丽娟等[9]研究指出，喉癌组织中let-7a水平明显下调，且与肿瘤分期和淋巴结转移有关。周恩等[21]研究指出，let-7a能够抑制喉癌细胞增殖，并加速其凋亡，喉癌患者的血清let-7a水平较低，且let-7a水平与喉癌患者的淋巴结转移情况有关，let-7a有助于术后病情监测。许文景等[22]研究显示，肝细胞癌患者血清和肝癌组织中let-7a呈异常低水平表达，且肝癌组织中let-7a水平远低于癌旁组织。武燕和王福花[23]的研究指出，宫颈癌患者的血清let-7a呈低表达。本研究中，死亡组患者的let-7a水平明显低于生存组（P＜0.01），与上述研究报道的结果一致。也有研究发现，let-7a与乳腺癌[24]、肝细胞癌[25]、卵巢癌[26]等患者的预后有关。但血清let-7a水平能否用于预测喉癌手术患者的预后尚未见报道。本研究进一步进行Logistic回归分析，结果显示，肿瘤类型、分化程度、T分期、TNM分期及let-7a水平均是喉癌手术患者预后的独立影响因素（P＜0.05）。ROC曲线分析结果显示，血清let-7a水平预测喉癌手术患者预后的曲线下面积为0.923，截断值为0.66，灵敏度为85.70%，特异度为84.40%，表明let-7a对喉癌手术患者预后具有重要的预测价值。综上所述，let-7a是喉癌手术患者预后的独立预测因子，对预测喉癌手术患者预后具有重要意义。但本研究也存在不足，首先，本研究属于单中心回顾性研究，仅对患者入院时的血清let-7a水平进行了检测，未动态监测其水平变化；其次，本研究样本量较小，仍需大规模多中心研究加以验证。