多套仪器组成的新型冠状病毒核酸检测系统的性能验证方案设计*

轩乾坤，温冬华，李广波，郭文正，杨思敏，羽晓瑜

同济大学附属东方医院南院检验科，上海 200123

新型冠状病毒肺炎(COVID-19)正在全世界范围内暴发，实验室核酸检测结果是COVID-19诊断的重要依据。《新型冠状病毒肺炎防控方案(第八版)》及其附件10《新冠病毒样本采集和检测技术指南》[1]指出：新型冠状病毒的病原学检查应对其进行核酸检测[2-7]，现国内各医学实验室基本采用实时荧光定量PCR来进行检测。党中央、国务院高度非常重视新型冠状病毒核酸检测工作，中央应对新型冠状病毒感染肺炎疫情工作领导小组会议作出部署，要求着力提升新型冠状病毒核酸检测能力，尽力扩大检测范围，要求加强各地实验室建设，使其具备开展新型冠状病毒核酸检测的能力[8-10]。故全国各三级医院、传染病专科医院、县(区)级及以上疾控机构、海关等实验室均安装了多台核酸提取仪和多台实时荧光定量PCR仪，可以多台仪器同时工作以完成新冠病毒核酸检测工作。

《医学实验室质量和能力认可准则(ISO15189:2012)》和《新型冠状病毒肺炎防控方案(第八版)》的附件10《新冠病毒样本采集和检测技术指南》均要求，实验室应对检测系统(包括核酸提取试剂、核酸提取仪、核酸扩增试剂和荧光定量PCR仪)进行性能验证，以确定检验程序的性能特征是否符合厂商声明[1，11-12]。现通用的新型冠状病毒核酸检测均包括核酸提取和PCR扩增两个过程，其核酸提取试剂和核酸扩增试剂均是固定配套使用，为单一因素，而核酸提取仪和荧光定量PCR仪均有多台，并且存在随机组合的工作模式。现有文献报道的性能验证方案均是针对单套检测系统或不同试剂检测性能的比较[13-18]，因而对于多套检测系统进行性能验证方案设计，选择最好的方案，对保证检测质量，提高临床工作效率，降低消耗，具有重要意义。根据中国合格评定国家认可委员会(CNAS)2019年2月15日发布并实施的《分子诊断检验程序性能验证指南》[19]，针对临床工作中新型冠状病毒核酸在多台核酸提取仪和荧光定量PCR仪上提取和检测的情况，笔者制定出三套性能验证方案，现报道如下。

1 仪器与试剂

此次性能验证方案以4台核酸提取仪和4台荧光定量PCR仪为例来设计，4台核酸提取仪分别命名为核酸提取仪A、核酸提取仪B、核酸提取仪C、核酸提取仪D；4台荧光定量PCR仪分别命名为荧光定量PCR仪1、荧光定量PCR仪2、荧光定量PCR仪3、荧光定量PCR仪4；使用配套的核酸提取试剂和扩增试剂。

2 性能验证参数

2.1方法符合率 选取阴性标本5例和阳性样本(宜包含弱阳性的标本)10例，与参比方法进行比较，计算其符合率,应符合厂商试剂盒说明书中声明的标准。

2.2精密度

2.2.1批内精密度 取2份标本，1份阴性，1份弱阳性，两份标本各重复检测20次，记录阳性标本的CT值，并计算其变异系数(CV),应符合厂商试剂盒说明书中声明的标准。

2.2.2批间精密度 取2份标本，1份阴性，1份弱阳性，两份标本每天各重复检测4次，连续检测5 d，共计20次，记录阳性标本的CT值，并计算其CV,应符合厂商试剂盒说明书中声明的标准。

2.3检出限 使用定值标准物质的标本，梯度稀释至厂家声明的检出限浓度，重复测定5次，必须100%检出靶核酸。

3 设计的三套性能验证方案

3.1方案一 将1台核酸提取仪和1台荧光定量PCR仪绑定在一起作为一套系统，共验证4套检测系统的方法符合率、精密度和检出限，见图1。

图1 性能验证方案一流程图

3.2方案二 按照排列组合的原理，将4台核酸提取仪和4台荧光定量PCR仪的16种组合形式均做一次性能验证，共验证16套检测系统的方法符合率、精密度和检出限，见图2。

图2 性能验证方案二流程图

3.3方案三 (1)在核酸提取仪A上提取核酸后，分别在荧光定量PCR仪1、荧光定量PCR仪2、荧光定量PCR仪3和荧光定量PCR仪4上扩增检测，主要验证4台荧光定量PCR仪的方法符合率、精密度和检出限；(2)在核酸提取仪A、核酸提取仪B、核酸提取仪C、核酸提取仪D上分别提取核酸后，均在荧光定量PCR仪1上扩增检测，主要验证4台核酸提取仪的方法符合率、精密度和检出限。见图3。

图3 性能验证方案三流程图

4 三套方案的比较

对三套性能验证方案进行比较，见表1、2。

表1 三套性能验证方案的比较

表2 三套性能验证方案优缺点比较

5 小 结

目前通用的新型冠状病毒核酸检测流程均包括核酸提取和PCR扩增两个步骤，检测系统包括核酸提取试剂、核酸提取仪、核酸扩增试剂和荧光定量PCR仪四个部分，在进行性能验证时，应确保覆盖到所有部分；而在实际性能验证工作中，对核酸提取仪的验证往往被忽略。核酸提取仪有分液、加热、磁吸、震荡和排风等功能，在核酸提取过程中，这些功能对提高核酸提取效率有非常重要的作用，工作人员在做性能验证时应引起重视。本课题组根据核酸提取仪和荧光定量PCR仪的不同组合，设计出了三套性能验证方案。

以配置4台核酸提取仪和4台荧光定量PCR仪为例，通过对三套性能验证方案的比较分析，笔者认为方案三最优。首先，在1台核酸提取仪上提取核酸，分别在4台荧光定量PCR仪上扩增检测，验证了4台荧光定量PCR仪的性能；然后，分别在4台核酸提取仪上提取核酸，在同一台荧光定量PCR仪上扩增检测，验证了4台核酸提取仪的性能；达到了16套组合检测系统的验证效果，保证了新型冠状病毒核酸检测的质量，试剂消耗和时间成本适中，可以有效、经济、快速地评估各性能参数是否符合厂商的声明。该性能验证方案可以推广，供其他实验室参考。