慢性真菌性鼻-鼻窦炎病原学分析*

隋文君，胡旭辰，刘向祎△

1.首都医科大学附属北京同仁医院检验科,北京 100730；2.首都医科大学2017级医学检验技术专业,北京 100069

真菌性鼻-鼻窦炎(FRS)是一种独立的特异性感染性鼻部炎症性疾病[1]。慢性真菌性鼻-鼻窦炎(CFRS)是慢性鼻-鼻窦炎(CRS)的一种，通常根据真菌感染是否仅局限在鼻窦腔内，是否侵犯黏膜和骨壁等病理特点，将CFRS分为真菌感染侵犯鼻窦黏膜与骨壁的慢性侵袭型真菌性鼻-鼻窦炎(CIFRS)和感染仅在鼻窦腔内的慢性非侵袭性真菌性鼻-鼻窦炎(CNIFRS)两大类。CNIFRS进一步根据病理改变的不同分为真菌球型鼻窦炎(FB)和变应性真菌性鼻-鼻窦炎(AFRS)[2]。AFRS发病率为5%～10%[3]。近年来，由于空气污染严重，慢性病(如糖尿病、肿瘤等)多发和抗菌药物的不合理应用使得CFRS发病率逐年上升,其在中国和欧洲人群中的发病率分别为8%和10.9%[4-5]。然而，CFRS的病原学数据尚不完善，并且其确切病因和发病机制尚未完全阐明。CFRS作为感染性疾病必然与微生物感染、微生态环境和宿主免疫反应密切相关[6]。随着病原微生物检测技术的不断发展，CFRS的病原学数据越来越丰富。本课题组通过分析2016-2020年CFRS患者的临床资料及从其鼻内镜手术中获取的鼻分泌物标本的微生物培养数据，获取了CFRS的病原学信息，旨在为其发病机制的研究提供病原学依据。

1 资料与方法

1.1一般资料 将2016—2020年于北京同仁医院就诊的经临床特征、鼻内镜检查、影像学和病理学检测确诊为CRS的患者共756例纳入研究，男性205例、女性551例，年龄10～87岁，病程1～4年。

1.2仪器与试剂 基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱仪(德国Bruker公司);革兰染色液、乳酸酚棉蓝染液(北京威泰克公司);血琼脂平皿、巧克力琼脂平皿和麦康凯琼脂平皿(Thermo Fisher公司);厌氧血琼脂平皿、固体沙保罗平皿和转运拭子(天津金章公司)。

1.3方法

1.3.1收集临床资料 收集并记录所有纳入研究者的临床资料，包括性别、年龄、临床诊断、病变部位等。

1.3.2标本采集 所有患者均行鼻内镜下鼻窦开放窦腔内容物清除术进行标本采集。CFRS的内容物一般呈棕色或棕绿色干酪样或泥沙状，非真菌性CRS的内容物多为黏性或黏脓性。所有标本置于含有保存培养基的转运拭子中保存和转运，均在60 min内送至微生物室进行培养。

1.3.3涂片镜检及培养鉴定 直接镜检:取标本少许涂于3张载玻片上，其中2张用于真菌镜检，分别进行氢氧化钾溶液(2.5 mol/L)压片和乳酸酚棉蓝染液压片，盖上盖玻片观察真菌特异结构(如真菌孢子和菌丝)；第3张用于革兰染色，观察炎症细胞及细菌形态。所有送检标本接种于不同培养基并置于不同培养环境进行普通细菌、厌氧菌和真菌的培养。血琼脂平皿、巧克力琼脂平皿置于35 ℃、5% CO2环境培养2～3 d;麦康凯琼脂平皿置于35 ℃环境培养2～3 d;厌氧血琼脂平皿置于35 ℃厌氧箱培养2～5 d;沙保罗培养皿置于25 ℃环境培养5～28 d。主要采用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱仪(MALDI-TOF MS)进行微生物鉴定；真菌菌种鉴定除采用MALDI-TOF MS鉴定外，同时还需要结合真菌形态学进行鉴定，主要包括菌落形态及压片镜检真菌的菌丝、孢子和产孢结构、方式等特征。如果两种方法鉴定结果不一致，则进行真菌内转录间隔区(ITS)测序鉴定。

2 结 果

2.1CFRS患者的临床特征分析 纳入研究的CRS患者中，CFRS患者占56.3%(426/756)，非真菌性CRS患者占43.7%(330/756)。CFRS多见于成年人，女性多发,上颌窦病变所占比例最高[66.2%(282/426)]，见表1。426例CFRS均为CNIFRS，其中真菌球(FB)占56.1%(239/426)，AFRS占43.9%(187/426)。FB多为女性，病变部位多为单侧鼻窦，而AFRS多累及双侧/全组鼻窦，两者患者的性别构成、病变累及部位比较差异有统计学意义(P<0.05)。见表2。

表1 2016—2020年426例CFRS患者临床特征分析

表2 2016—2020年FB、AFRS患者临床特征比较

2.2CFRS的病原学分布 从426例CFRS患者的临床标本中：共分离出真菌226株，其中曲霉菌197株(87.2%，包括黄曲霉99株、烟曲霉81株和其他曲霉17株)、链格孢霉11株、普通裂褶菌4株、尖端赛多孢子菌9株；共分离出细菌345株，分离数量排前3位的为凝固酶阴性葡萄球菌(58株)，金黄色葡萄球菌42株，铜绿假单胞菌32株，厌氧菌主要为普雷沃菌(9株)、具核梭杆菌(3株)、消化链球菌(6株)和丙酸杆菌(7株),见表3。CFRS患者中单纯真菌感染216例(50.7%)，真菌、细菌混合感染210例(49.3%)，其中混合感染1种细菌83例(19.5%)，混合感染2种及以上细菌127例(29.8%)，未发现真菌混合感染的病例，见表4。

表3 2016—2020年CFRS的病原体分布情况

续表3 2016—2020年CFRS的原体分布情况

表4 2016—2020年CFRS患者真菌、细菌混合感染情况分析[n(%)]

2.3FB与AFRS患者真菌培养结果比较 培养结果显示FB患者中真菌培养阳性157例(65.6%)；AFRS患者中真菌培养阳性69例(36.9%)，两者比较差异有统计学意义(χ2=34.93，P<0.001)。FB和AFRS均以曲霉菌为主要致病真菌，但AFRS感染的真菌中链格孢霉(13.04%)和尖端赛多孢子菌(10.14%)所占比例高于FB患者(均为1.27%)，差异有统计学意义(P<0.05)。

2.4混合细菌感染的CFRS与非真菌性CRS细菌病原学分布比较 混合细菌感染的CFRS(210例)与非真菌性CRS(330例)的细菌病原学分布情况见表5。CFRS和非真菌性CRS的细菌病原学分布较为接近，差异无统计学意义(P>0.05)。

表5 混合细菌感染的CFRS和非真菌性CRS的细菌病原学分布[n(%)]

3 讨 论

真菌广泛存在于自然环境中，大多属于条件致病菌。真菌感染多发生于免疫缺陷(接受移植、糖皮质激素或免疫抑制药治疗，有HIV感染或白血病等)、菌群失调(广谱抗菌药物的大量应用)和糖尿病患者[7-8]。然而，文献报道CNIFRS常见于免疫力正常个体[9]。自真菌性鼻窦炎作为一种独立的疾病被报道以来，研究发现绝大多数真菌性鼻窦炎不仅侵犯鼻窦，而且同时还侵犯鼻腔，因此美国耳鼻咽喉科学会建议用FRS来代替真菌性鼻窦炎[1]。FB患者窦腔内表现为致密的团块，由绿色、黄色、棕色或黑色的易碎乳酪状物质组成，很容易从窦腔黏膜上剥离[10]。AFRS则表现为对真菌抗原的超敏反应[11]。目前最常用的AFRS诊断标准是经典的Bent-Kuhn诊断标准，包括IgE介导的针对真菌的Ⅰ型超敏反应、CRS合并鼻息肉的存在、特征性CT特征、嗜酸性黏蛋白的存在以及真菌的特殊染色或培养阳性[12]。但目前真菌培养阳性率较低，并且FRS的病原学数据尚不完善。因此，本研究分析了2016—2020年北京同仁医院CFRS患者的病例资料和病原学数据。

本研究共收集了CFRS患者426例，其中包括239例(56.1%)FB和187例(43.9%)AFRS。有文献报道，FB好发于成年女性，主要累及单侧鼻窦，以上颌窦最为多见，其次是蝶窦，最后是筛窦[13]。AFRS患者好发于成年人，男女比例较为接近，主要累及双侧鼻窦或全组发生[10]。本研究中，FB与AFRS的临床特征与上述文献报道较为一致。多数患者无基础性疾病，仅表现为鼻窦真菌感染，这可能与鼻部解剖结构异常有关，鼻腔肿物、鼻中隔偏曲、鼻息肉等均可能造成鼻窦口狭窄、阻塞、通气不畅，分泌物增多且滞留在窦内使窦腔内环境湿润，适于真菌生长。

本研究发现CFRS患者真菌和细菌混合感染比例较高,达到49.3%。共分离真菌226株，其中曲霉菌197株，以黄曲霉所占比例最高，其次为烟曲霉，结果与印度、韩国等亚洲国家的相关报道一致，而欧美一些国家报道的烟曲霉分离率高于黄曲霉[10，13-14]。分离得到细菌共345株，主要为凝固酶阴性葡萄球菌、金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌和肠杆菌目细菌等需氧或兼性厌氧菌，共分离厌氧菌25株。厌氧菌分离率较低，可能与厌氧菌体外培养条件要求更为苛刻，手术获取的标本量有限以及送检时长有关。目前关于CFRS患者细菌病原学分布的报道较少。CFRS患者标本的真菌培养阳性率较低，本研究显示FB患者真菌培养阳性率为65.6%，AFRS患者真菌培养阳性率为36.9%，AFRS患者明显低于FB患者。目前尚无关于这2种CNIFRS患者病原学比较的文献报道。CNIFRS患者真菌培养阳性率低的原因分析：(1)无论是FB患者还是AFRS患者，均属于CNIFRS，真菌在体内可能处于一种生长抑制状态，因此影响真菌的体外培养；(2)标本量较少，没有获取到含有活真菌的标本，尤其是AFRS患者的标本；(3)混合细菌感染，细菌成分影响或抑制真菌的生长[15-17]。

CRS是一种常见的多因素疾病,细菌感染对CRS的发病起着重要作用[13-14]。CFRS临床上是一种较为独特的CRS疾病。因此，本研究亦比较了CFRS与非真菌性CRS细菌病原学分布情况。CFRS患者中真菌细菌混合感染患者占27.8%，其病原学分布情况与非真菌性CRS较为接近，均以葡萄球菌属和肠杆菌目细菌为主。

本研究比较，总结了近5年北京同仁医院CFRS患者的基本临床特征和基于传统培养方法得到的CFRS病原学信息，为CFRS的病因学研究提供了一定的病原学数据。但本研究存在一定的局限性，主要表现在：(1)本研究为单中心的回顾性研究。(2)基于传统培养方法的病原学研究会受到体外培养条件的限制，本研究中的真菌、厌氧菌等苛养菌的分离率受到了影响。因此，本课题组正在利用基于二代测序技术的宏基因组测序(mNGS)病原学检测手段对CFRS患者鼻窦手术标本进行微生物组学分析，希望能对CFRS的病原学有更进一步的认识，从而为探讨CFRS的病因学和致病机制提供依据。