RNF5介导JAMP泛素化促进内质网应激和细胞凋亡参与妊娠期糖尿病发展的机制研究*

丁转南，黄丽珊，欧宜静，黄素然，黄 文△，禤文婷

南方医科大学附属东莞医院：1.妇产科；2.内分泌科，广东东莞 523000

妊娠期糖尿病(GDM)是妇女在妊娠期出现的糖尿病，全球发病率约占妊娠妇女总数的17.8%[1]。GDM会增加妊娠期其他并发症的发病风险，同时还可能增加胎儿死亡、生长受限的风险，因此需要对GDM采取积极干预措施，以免给母婴带来不良后果[2-3]。GDM是一种机制复杂的疾病，涉及胰岛B细胞衰竭、胰岛素抵抗、氧化应激与机体炎症等多种病理因素[3]。越来越多的研究表明，这些病理因素存在密切关联，即都可能来自于内质网应激[4-6]。高血糖会干扰内质网的蛋白质折叠和运输功能，这导致多肽在内质网中积累，并损害胰岛素的分泌。环指蛋白5(RNF5)是E3泛素蛋白连接酶，主要存在于内质网与线粒体中，在脑、心、肝、胎盘、胰腺等多种人体组织中均有表达[7]。JNK相关膜蛋白(JAMP)是一种将蛋白质招募到内质网的蛋白，近年来国外多项研究均报道了RNF5能将JAMP泛素化使其无法完成蛋白体招募和降解工作[8-10]。在错误折叠蛋白质无法完成降解清除而大量积累，会诱发内质网应激反应[11]。因此推测RNF5可能是通过介导JAMP泛素化而促进内质网应激，从而参与GDM发展，但目前国内外研究中仍无此方向的报道，于是本研究设计了从临床组织标本到体外细胞培养与动物模型实验，旨在探讨GDM中RNF5与内质网应激的关系，现报道如下。

1 材料与方法

1.1临床标本 收集2018年1月至2021年4月于本院行剖宫产的109例GDM产妇的胎盘组织标本作为GDM组。所有产妇均符合GDM的诊断标准[12]，经75 g糖耐量实验测定2 h血清葡萄糖水平>9.0 mmol/L；所有产妇均为单胎妊娠、凝血功能均正常；排除合并遗传性疾病、其他器质性疾病者及肿瘤患者。另外，收集同期的83例健康产妇胎盘组织标本作为对照组。本研究经本院伦理委员会审批，且所有纳入研究的产妇均对本研究知情同意。本研究中，GDM产妇年龄为(27.32±4.29)岁，平均分娩孕周为(39.32±2.69)周；健康产妇年龄为(27.18±4.52)岁，平均分娩孕周为(39.72±2.33)周。GDM产妇和健康产妇年龄、分娩孕周比较差异无统计学意义(P>0.05)。

1.2细胞与实验动物 人妊娠绒毛膜癌细胞系BeWo(货号：CL-0500)与人胚肾细胞HEK-293(货号：CL-0001)均购自武汉普诺赛生命科技有限公司，采用MEM培养基(添加10%胎牛血清和1%链霉素/青霉素)培养，置于5%CO2、37 ℃条件下培养。SPF级Balb/c小鼠36只购自南方医科大学实验动物中心，其中雌性24只，雄性12只，6～8周龄，体重为(24.15±2.62)kg，雌雄比例为2∶1。合笼饲养，每日早晨检查雌鼠阴栓，出现阴栓立即进行阴超检查，将7 d内出现妊娠症状的小鼠作为实验对象(本研究得到了15只)。动物的饲养与处理均符合实验动物伦理学要求。

1.3方法

1.3.1蛋白免疫印迹法检测蛋白水平 将组织标本/细胞裂解后，提取总蛋白，BCA试剂盒对总蛋白质进行定量，经电泳、转膜、封闭、抗体孵育后，采用ECL化学发光试剂盒进行显色，凝胶成像分析仪拍照后计算蛋白相对表达水平。检测的蛋白包括内质网应激标志分子：X盒结合蛋白1(XBP-1)、磷酸化真核翻译起始因子2α(p-eIF2α)、真核翻译起始因子2α(eIF2α)、C/EBP同源蛋白(CHOP)，以及RNF5。

1.3.2GDM模型细胞构建 采用体外高糖刺激BeWo细胞来模拟GDM胎盘组织细胞，在体外构建GDM模型细胞。将对数生长期的BeWo细胞分为正常对照组、模型对照组、siRNA-NC组、siRNA-RNF5组。正常对照组在葡萄糖浓度为5 mmol/L的培养基中培养。其余3组均采用葡萄糖浓度为25 mmol/L的培养基进行培养；其中，模型对照组不进行转染；siRNA-NC和siRNA-RNF5组在培养24 h后进行转染：采用Lipofectamin2000转染试剂盒，将50 nmol/L siRNA-NC、siRNA-RNF5(由上海吉玛制药公司合成)分别转染至对数生长期的siRNA-NC组、siRNA-RNF5组细胞。

1.3.3细胞活力与凋亡检测 将细胞接种于96孔板，继续培养48 h，CCK-8法测定细胞活力，每孔加入10 μL CCK8试剂，37 ℃孵育2 h，酶标仪测定450 nm波长的吸光度(A)值，计算细胞活力；采用Annexin-V-FITC/PI凋亡检测试剂盒测定细胞凋亡率，取100 μL细胞悬液和Annexin-V-FITC、PI于黑暗环境下孵育15 min后，采用流式细胞仪进行检测。

1.3.4体外泛素化实验 将FLAG-JAMP和siRNA-CN(或siRNA-RFN5)转染至HEK 293细胞，对照组细胞不进行转染。细胞转染42 h后加入泛素蛋白酶抑制剂MG132，孵育6 h后收集细胞，加入500 μL细胞裂解液于4 ℃裂解后取上清液，留取40 μL作为Input标本，剩余部分加入20 μL 抗-FLAG磁珠于4 ℃过夜，低速离心弃上清，再加入1 mL细胞裂解液4 ℃低速离心弃上清，重复几次后煮沸取上清液进行电泳，采用蛋白免疫印迹法检测蛋白质，方法同1.3.1。

1.3.5构建GDM模型小鼠 将15只孕鼠单笼喂养，3只作为正常对照组，其余12只用于构建GDM模型。GDM模型小鼠在禁食12 h后，经腹腔注射链脲佐菌素(湖南汇百侍生物科技有限公式，批准文号：国药准字H20020475)50 mg/kg，正常对照组则注射等量的枸橼酸钠缓冲液，4 h后开放进食与饮水。7 d后进行2 g/kg的口服葡萄糖耐量试验(OGTT)，并检测空腹血糖(FBG)、空腹胰岛素(FINS)水平，计算稳态模型胰岛素抵抗指数(HOMA-IR)，HOMA-IR=FBG×FINS/22.5。将FBG≥5.1 mmol/L，且FINS、HOMA-IR均升高，则表示GDM模型构建成功。

1.3.6siRNA-RFN5干预GDM模型小鼠 将成功构建GDM模型的9只小鼠平均分为3组(每组3只)，分别作为模型对照组、siRNA-NC组与siRNA-RFN5组。分别将20 μg siRNA-NC、siRNA-RFN5溶于2.5 mL生理盐水中，经尾静脉分别注射入siRNA-NC组与siRNA-RFN5组小鼠，模型对照组则注射等体积生理盐水，干预4周。在干预期间检测和记录小鼠体重、FBG、FINS水平并计算HOMA-IR。在干预4周后处死小鼠，取出胎盘组织，检测RNF5与内质网应激分子的表达情况。

2 结 果

2.1两组胎盘组织中RNF5的表达情况比较 GDM组RNF5相对表达水平高于对照组(0.25±0.09vs.0.12±0.05，t=9.616,P<0.001)，见图1。

注：Normal表示对照组；GDM表示GDM组。

2.2胎盘组织中内质网应激标志分子水平及其与RNF5表达的关系 GDM组XBP-1、CHOP相对表达水平和p-eIF2α/eIF2α均高于对照组(1.35±0.47vs.0.48±0.12、0.81±0.33vs.0.41±0.18、0.81±0.18vs.0.42±0.11，t=15.55、10.00、10.94，P<0.01)，见图2。对GDM组上述应激标志水平与RNF5蛋白相对表达量进行相关性分析发现，RNF5相对表达水平与XBP-1、p-eIF2α/eIF2α、CHOP均呈正相关(r=0.300、0.450、0.229，P<0.05)。

2.3下调RNF5表达对高糖环境下BeWo细胞内质网应激与细胞凋亡的影响 模型对照组、siRNA-NC组RNF5表达水平较高于正常对照组，且伴随着内质网应激标志(XBP-1、CHOP、p-eIF2α/eIF2α)水平的升高，而下调了RNF5表达的iRNA-RNF5组细胞上述内质网应激标志水平降低，见图3。体外泛素化实验结果显示，下调RNF5表达减轻了JAMP泛素化程度，见图4。此外CCK8法测得模型对照组较正常对照组活力降低(0.72±0.05vs.1.253±0.10，t=8.499，P=0.001)，细胞凋亡率升高[(13.32±0.74)%vs.(1.24±0.06)%，t=28.28，P<0.001)]，而iRNA-RNF5组(下调RNF5表达)较siRNA-NC组细胞活力更高(0.97±0.04vs.0.67±0.05，t=7.48，P=0.002)，凋亡率降低[(6.72±0.68)%vs.(14.58±1.25)%，t=9.540，P<0.001)]，见图5。以上结果提示，在GDM细胞模型中RNF5通过介导JAMP泛素化诱发了内质网应激和细胞凋亡。

注：Normal表示对照组；GDM表示GDM组。

注：Control表示正常对照组；Model表示模型对照组；siRNA-NC表示siRNA-NC组；siRNA-RFN5表示siRNA-RFN5组。

注：Control表示对照组；siRNA-NC表示转染siRNA-NC的细胞；siRNA-RFN5表示转染siRNA-RFN5的细胞；IP表示免疫沉淀；IB表示免疫印迹；UBI表示泛素。

注：Control表示正常对照组；Model表示模型对照组；siRNA-NC表示siRNA-NC组；siRNA-RFN5表示siRNA-RFN5组。

2.4下调RNF5表达对GDM模型小鼠胰岛素抵抗与内质网应激的影响 GDM模型建立2、4周时，模型对照组小鼠体重均低于正常对照组小鼠(28.04±0.07vs.32.16±0.41、31.00±0.66vs.37.93±0.30，t=17.157、16.556，P<0.001)；而0、2周与4周的FBG水平高于正常对照组[(15.53±0.53)mmol/Lvs.(5.02±0.10)mmol/L、(16.02±0.27)mmol/Lvs.(5.12±0.04)mmol/L、(16.10±0.70)vs.(5.09±0.27)mmol/L，t=33.751、69.169、25.417，P<0.001)]，HOMA-IR也高于正常对照组(5.80±0.37vs.2.07±0.21、6.33±0.29vs.2.14±0.24、7.12±0.17vs.2.02±0.19，t=15.186、19.279、34.648，P<0.001)。在siRNA-RNF5干预2、4周时，siRNA-RNF组小鼠体重高于siRNA-NC组[(27.90±0.26)gvs.(31.01±0.24)g、(31.31±0.40)gvs.(36.84±0.32)g，t=15.224、18.698，P<0.001]，小鼠FBG水平[(12.90±0.29)mmol/Lvs.(16.18±0.43)mmol/L，(9.33±0.21)mmol/Lvs.(16.11±0.20)mmol/L，t=10.954、40.494，P<0.001]与HOMA-IR(4.54±0.16vs.6.38±0.33，3.71±0.13vs.7.11±0.23，t=8.690、22.290，P<0.001)也高于siRNA-NC组。GDM模型对照组小鼠胎盘组织内RNF5表达水平升高，伴随着内质网应激标志分子表达的增强，而当siRNA-RNF5干预4周后，小鼠胎盘组织中RNF5水平与内质网应激标志水平均降低，见图6。以上结果提示下调RNF5表达可减轻GDM模型小鼠胰岛素抵抗与胎盘内的内质网应激。

注：Control表示正常对照组；Model表示模型对照组；siRNA-NC表示siRNA-NC组；siRNA-RFN5表示siRNA-RFN5组。

3 讨 论

胎盘是分泌多肽较多的器官，容易受到内质网应激的影响，在内质网应激状态下胎盘功能失调，可能会改变母体新陈代谢的平衡，并导致GDM。国外研究已证明了胎盘内质网应激在妊娠并发症的病理生理学中的核心作用[13]。

本研究观察到，与正常产妇胎盘组织相比，GDM产妇胎盘组织中RNF5呈高表达，同时伴随着内质网应激标志水平的升高，且RNF5与内质网应激标志水平呈正相关，提示RNF5可能通过诱发内质网应激来促进GDM发展。在细胞受到高糖环境刺激时，内质网形态和功能受破坏，蛋白质加工和运输受阻，使得内质网积累了大量错折叠或未折叠蛋白，引发细胞采取一系列应答措施来缓解内质网压力，促进内质网功能恢复[14-15]。而由错误折叠或未折叠蛋白质在内质网腔内大量积累会引发一系列反应，是糖尿病发生的重要病理机制[16-17]。在发生内质网应激时，作为内质网传感器的XBP-1表达上调，XBP-1是一种转录活化因子，诱发细胞内未折叠蛋白反应(UPR)，从而引发下游eIF2α磷酸化成为p-eIF2α并失活，促使胞内蛋白质合成终止，同时引起促凋亡分子CHOP表达增加[18-20]。

体外细胞实验证明，高糖环境刺激BeWo细胞会导致RNF5与内质网应激标志水平升高、细胞凋亡率升高、细胞活力降低，而下调RNF5能通过减轻JAMP泛素化降低高糖环境下的BeWo细胞内的内质网应激标志水平，同时减少细胞凋亡，增强细胞活力。JAMP是锚定在内质网膜上的一种跨膜蛋白，是多种蛋白复合体中的重要组件，可促进内质网内的错误折叠蛋白的清除；RNF5作为泛素化连接酶，介导了JAMP的泛素化，但是不影响JAMP的稳定性[8,10]。而JAMP泛素化后无法再组装内质网相关降解的蛋白复合体，导致内质网功能的失调，进而诱发了内质网应激，促进了细胞凋亡[11]。

随后的研究探讨了下调RNF5是否在体内也能缓解内质网应激从而改善GDM症状，结果显示下调RNF5表达可减轻GDM模型小鼠胰岛素抵抗症状，同时可降低胎盘内的内质网应激分子表达水平。既往LIONG等[21]学者研究中对GDM模型采用内质网应激抑制剂来进行干预，发现GDM模型中的胰岛素抵抗得到了改善，明确证实了内质网应激在GDM发病中的重要作用。结合此文献结果，本研究可基本确定RNF5是通过诱导内质网应激与细胞凋亡来促进GDM进展的。

综上所述，GDM产妇胎盘组织中RNF5表达水平存在异常升高，高RNF5水平通过泛素化JAMP诱发内质网应激与细胞凋亡，从而促进了GDM的发展，而下调RNF5表达水平可以逆转此过程，从而抑制GDM的进展。