基因检测指导耐克拉霉素幽门螺杆菌个体化治疗的研究*

尤文佳，何帮顺，潘玉琴，孙慧玲，许 桃，王书奎△

1.南京医科大学附属南京医院中心实验室，江苏南京 210000；2.江苏省泰兴市人民医院输血科，江苏泰兴 225400

幽门螺杆菌(Hp)是一种微需氧的革兰阴性螺旋杆菌[1]。Hp感染与消化性溃疡、萎缩性胃炎、黏膜相关淋巴样组织(MALT)淋巴瘤及胃癌有密切的关系[2]。Hp的感染具有家族聚集性[3]，根除Hp能有效地阻断其传播，防止感染者发展成慢性胃炎，降低消化性溃疡发病率及复发率，有效缓解MALT淋巴瘤[4]，预防胃癌的发生[5]。然而，随着药物根除Hp治疗的广泛应用及抗菌药物的滥用，Hp耐药性逐年升高[6]，Hp的根治率在不断下降。为了调查Hp对克拉霉素的耐药性，并探究其与耐药基因检测的一致性，本研究选用K-B法检测了Hp对克拉霉素的耐药性，并选用检测了这些临床分离菌株耐药基因突变状况。根据药敏试验结果进行个体化治疗并评价Hp根除情况，可以为耐药Hp的用药选择提供依据。

1 资料与方法

1.1一般资料 将2018年4月至2018年12月于南京医科大学附属南京医院就诊，初始未治疗但经13C呼气试验检测为Hp阳性的284例Hp感染病例纳入研究(上述病例均在胃镜室采集过胃组织活检标本)。从纳入研究的病例中随机抽取222例作为试验组(将进行克拉霉素药敏试验和耐药基因突变检测)，其余的62例作为对照组(不进行克拉霉素耐药的相关检测)，两组间年龄、性别等一般资料比较差异无统计学意义(P>0.05)，具有可比性。排除标准：(1)内镜检查证明有活动性出血者；(2)已接受过Hp根除治疗的患者；(3)近2周内服用过质子泵抑制剂、H2受体拮抗剂以及近4周内服用过抗菌药物、铋剂者；(4)曾对本次医治所用的药物有过敏史或皮试阳性者；(5)孕期及哺乳期者；(6)患者同时服用非甾体抗炎药或酗酒者；(7)存在其他影响本研究结果的严重疾病，如严重的肝病、心脏病、呼吸系统疾病等。本研究经医院伦理委员会同意，所有患者均签署知情同意书。

1.2仪器与试剂 HF100型三气培养箱为力康生物医疗科技控股有限公司产品；CX41RF型光学显微镜为日本Olympus公司产品；Hp标准株NCTC11637购自上海芯超医学检验所有限公司；HiPure Bacterial DNA Kit试剂盒购自美基生物有限公司；Hp耐药突变位点检测试剂盒购自江苏默乐公司；PCR Mix试剂购自上海翊圣生物科技有限公司；M-H琼脂培养基(干粉)购自广东环凯生物公司；脑心浸出液肉汤购自海博生物公司。

1.3方法

1.3.1取样及培养 在胃镜下用灭菌活检钳夹取距幽门前2～3 cm大弯或小弯处胃黏膜组织，用接种环将组织黏膜连同细菌的混匀营养液均匀接种在分离培养基上。取少量菌液加入快速尿素酶反应管后标注编号，观察结果后记录。再将培养基放入培养箱(O2:5%，CO2:10%，温度：37 ℃)培养3～5 d。取出初代培养成功的菌株进行二代培养，并进行细菌形态(革兰染色)和生化鉴定(快速尿素酶试验和氧化酶试验)。

1.3.2药敏试验 取出二代菌的培养基，配制成3×108CFU/mL的菌悬液2份各800 μL。将上述其中1份细菌悬液均分等体积分别均匀涂布于2块含10%羊血的M-H琼脂平板培养基上，将克拉霉素药敏纸片贴于平板(3个/板)，将平板放于培养箱中培养48 h。按照中国药品生物制品检验制订的抗菌药物细菌耐药性检测中心发布的《抗菌药物药敏实验判定标准》[7]判定抗菌药物药敏实验结果，以克拉霉素最低抑菌浓度≥1 mg/L为耐药，<1 mg/L为敏感。

1.3.3Hp基因组提取与耐药基因分析 使用DNA提取试剂盒进行Hp的基因组提取，PCR检测耐药突变位点。PCR反应体系：PCR Mix 25 μL，引物(10 μmol/L)5 μL，水10 μL，DNA 10 μL。PCR反应条件：94 ℃预变性5 min；94 ℃变性10 s，55 ℃退火20 s，72 ℃延伸30 s，40个循环；最后72 ℃终延伸5 min。

1.3.4治疗 对照组患者及试验组中经药敏试验判定为敏感的患者给予奥美拉唑[20 mg 一日两次(bid)]+阿莫西林(1 000 mg bid)+克拉霉素(500 mg bid)方案治疗；试验组中经药敏试验判定为耐药的患者给予奥美拉唑(20 mg bid)+阿莫西林(1 000 mg bid)+呋喃唑酮(100 mg bid)+铋剂方案[6]。连续服药2周，用药期间不得服用其他药物，每日三餐需分餐。停药4周后经13C呼气实验，检测根除情况。

2 结 果

2.1药敏试验和耐药基因分析 试验组222例胃黏膜的活检标本中均分离出Hp菌株，涂片和革兰染色显示Hp菌株多呈弧形逗号状、海鸥形态、短杆弯曲，见图1。K-B法体外药敏试验显示：敏感155例(69.82%)，耐药67例(30.18%)。PCR检测：检测到Hp对克拉霉素的耐药基因突变为23S rRNA V区的A2143G和A2142G突变，A2143G突变68例(94.44%)，A2142G突变4例(5.56%)。155例敏感病例中，150例(96.74%)23S rRNA V区无突变，5例(3.26%)23S rRNA V区有突变，67例耐药病例均为23S rRNA V区突变，见图2。药敏试验与耐药基因检测的一致性较好(Kappa=0.023,P=0.609)。

图1 显微镜下观察Hp革兰染色形态(×1 000)

注：A为23S rRNA V区突变位点A2143G的检测；B为23S rRNA V区突变位点A2142G的检测；M表示分子标准带；1、2、7、8表示23S rRNA V区无位点突变；3、4表示存在23S rRNA V区A2143G突变(304、101 bp 2条带)；5、6表示存在23S rRNA V区A2142G突变(332、93 bp 2条带)。

2.2试验组中敏感和耐药患者一般情况比较及各组间Hp根除疗效比较 试验组中的敏感和耐药患者一般资料比较差异无统计学意义(P>0.05)，见表1。敏感和耐药患者的Hp根除率均超过86.00%。对照组患者Hp根除率仅为67.74%。试验组Hp根除率高于对照组(P<0.05)，见表2。

表1 试验组中耐药和敏感患者的一般情况比较

表2 各组间Hp根除率比较[n(%)]

3 讨 论

根除Hp最好初次治疗就选用疗效高的方案，由于存在抗菌药物滥用和治疗方案不规范的情况，Hp根除率呈下降趋势[8-9]。目前，我国治疗Hp最常用的抗菌药物为克拉霉素，但临床实践显示Hp对克拉霉素的耐药率逐年上升，高达20%～50%[10]，这也是Hp根除率下降的主要原因。有研究报道Hp耐药菌株感染者的Hp根除率为20%～40%[11]，而理想的治疗方案的根除率需要超过90%[12]。在中国，不同地区Hp的耐药率也有差别[13]。2009—2014年，浙江省嘉兴市Hp克拉霉素耐药率为17.76%[14]。2013—2014年，北京地区Hp克拉霉素耐药率为52.6%[15]。同时也有研究表明，克拉霉素在首次用药后，若根除治疗失败极易使细菌产生耐药性[16]。因此，了解抗菌药物耐药情况对Hp根除方案的制订有着重要的指导作用。

本研究中，对照组62例患者Hp根除率仅有67.74%，与文献报道基本吻合[17]。本研究采用PCR检测Hp 23S rRNA V区的克拉霉素耐药基因突变，结果显示突变位点有2个，分别为A2143G和A2142G。既往的研究表明，Hp23S rRNA V区域的点突变是导致大环内酯类抗菌药物耐药的主要原因，抑制了克拉霉素与相应的核糖体亚基的结合，造成蛋白质合成障碍[18-19]。本研究中的一致性分析显示：克拉霉素耐药的药敏试验结果与Hp23S rRNA V区基因突变的检出有高度的一致性；155例敏感患者中有150例(96.74%)23S rRNA V区基因无突变，5例(3.26%)23S rRNA V区基因发生突变；67例耐药患者均有23S rRNA V区基因突变。仍有克拉霉素敏感的患者检出23S rRNA V区基因突变，这是否与杂合感染的存在或者是细菌本身存在多种突变相关，仍需要进一步的探讨。

将62例未进行药敏试验的患者作为对照组，给予奥美拉唑+阿莫西林+克拉霉素治疗；222例患者作为试验组，其中155例敏感患者同样给予奥美拉唑+阿莫西林+克拉霉素治疗，67例耐药患者给予奥美拉唑+阿莫西林+呋喃唑酮+铋剂治疗。给予连续2周的治疗，结果显示，试验组患者有较好的Hp根除疗效，两类患者的Hp根除率均超过86%[20]，Hp根除率明显高于对照组(67.74%)。

本研究中，对耐药患者直接使用呋喃唑酮进行治疗，可提升初次治疗的根治率，减少患者无效抗菌药物使用；对敏感患者使用克林霉素，可避免直接使用更高级的抗菌药物呋喃唑酮，减少临床抗菌药物滥用。对于存在Hp感染的患者，先进行药敏试验或耐药基因检测，然后制订个体化的治疗方案，可以达到精准给药的目的，提高Hp的根除率，减少抗菌药物滥用。

综上所述，本研究发现Hp对一线治疗药物克拉霉素存在耐药情况，应结合药敏试验和耐药基因突变检测进行针对性地治疗，有效根除Hp。