QuEChERS-超高效液相色谱-串联质谱法测定牛乳中6 种农药残留

张晓敏，孟根花，蔺婷娟，陈秀梅，陈喜荣

（内蒙古伊利实业集团股份有限公司，内蒙古 呼和浩特 010110）

为了能够快速提高果蔬、粮食产量，大量农药被广泛应用甚至滥用[1-2]，一些农药可以长期存在于土壤和环境中，并在人体和动植物体内不断累积，威胁人类健康，农药残留问题近年来引起各界对食品安全的关注[3-5]。牛乳中含有多种人体所需的氨基酸、维生素等营养成分，是老幼皆宜的营养食品[6-8]。牛乳中的农药残留主要与动物饲料使用的农药有关，如稻米、玉米、高粱、麦类和豆类等，施用品种多样，且产业链较长，会在运输过程中受到各种污染，影响到牛乳的安全性[9]，在牛乳生产过程中建立一种快速、准确的检测方法对农药残留进行监控是较为紧迫的问题。目前，国内外检测农药残留的方法主要有色谱法和色谱-质谱法[10]，有文献也报道了多壁碳纳米管-聚醚砜复合膜净化法，快速测定食品中农药残留效果较好[11]，脂质去除分散固相萃取法-气相色谱-串联质谱法测定鸡蛋中农药残留，结果优异[12]。色谱-质谱联用法具有专一性强、灵敏度高等优势，是较好的检测方法[13-15]。超高效液相色谱-串联质谱法适用于基质复杂、干扰严重的痕量化合物的分析，且有灵敏、快速和定性准确等特点[16]。由于牛乳中含有脂肪、蛋白质、有机酸和糖类等干扰成分，对样品前处理要求必须除去干扰成分来避免对仪器的污染[10]。QuEChERS技术是近年新兴的一种不用浓缩、快速检测多种农药残留的前处理方法[17-18]，利用盐包除去水分及盐析，净化包除去糖类、脂肪酸、脂类、有机酸及色素等干扰物，可减小基质效应[10]。该技术具有快速、简单与节省试剂等优点，已有研究在牛乳、豆乳及乳制品中得到广泛应用[19-22]，解决了传统方法中费时和浪费试剂等问题[23]。

本研究应用超高效液相色谱-串联质谱法建立一种同时检测牛乳中6 种农药残留的快速检测方法。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

牛乳样品 市售。

标准物质（纯度均大于98.0%）：噻虫胺 德国Dr.Ehrenstorfer公司；吡虫啉、灭多威、杀线威、嘧菌酯、多菌灵 北京坛墨公司；乙腈（色谱纯） 德国Meker公司；甲醇（色谱纯） 美国Fisher公司。

盐包：MgSO4（4.0 g）、NaCl（1.0 g）、TSCD4（1.0 g）、DHS（0.5 g）和净化包：150 mg乙二胺-N-丙基硅烷（ethylenediamine-N-propyl silane，PSA）/900 mg MgSO4中国迪科马公司。

1.2 仪器与设备

3k30高速低温离心机 德国Sigma公司；LC-30AD超高效液相色谱仪 日本岛津公司；SCIEX Qtrap 5500三重四极杆质谱仪 美国Applied Biosystems公司；Multi Reax全能型振荡器 德国Heidolph公司；KQ-300DE超声波清洗仪 黑龙江立高设备公司；TurboVaP LV氮吹浓缩仪 瑞典Biotage公司。

1.3 方法

1.3.1 标准溶液配制

标准储备液（100 μg/mL）：分别吸取一定量各农药标准品于容量瓶中，用乙腈定容，于0～4 ℃避光保存。

6 种农药混合标准中间液（1 μg/mL）：分别移取0.1 mL各农药标准储备液于10 mL容量瓶中，用乙腈定容，于0～4 ℃避光保存。

1.3.2 样品前处理

称取10 g牛乳（精确到0.01 g），置于50 mL离心管中，准确加入10 mL乙腈于振荡器涡旋10 min进行提取，加入QuECHERS盐包，立即上下颠倒或涡旋摇晃，避免结块，继续涡旋10 min，在室温下4 000 r/min离心5 min，取上清液7 mL转移至15 mL含PSA净化剂的离心管中，振摇混匀，再次涡旋5 min，在室温下4 000 r/min离心5 min，准确吸取上清液4 mL，40 ℃氮吹至干。用1 mL体积分数5%甲酸-乙腈水溶液复溶，样液经0.2 μm滤膜过滤后上机分析。

1.3.3 标准曲线绘制

选择空白样品，不加入任何标准物质，经过样品前处理，得到定容液。稀释混合标准中间液，将6 种农药配制成质量浓度分别为1.0、2.0、5.0、10.0、40.0 μg/L的标准工作液，进样上机测定，横坐标为质量浓度（x），纵坐标为响应值（y），制作标准曲线。

1.3.4 液相色谱条件

色谱柱：安捷伦色谱柱Poroshell 120 EC-C18（2.1 mm×100 mm，2.7 µm），流动相A：体积分数0.1%甲酸溶液，流动相B：乙腈；流速0.45 mL/min；柱温40 ℃；进样体积3 μL；梯度洗脱程序：0～3.0 min，95%～70%流动相A；3.0～9.0 min，60%流动相A；9.0～16.0 min，1%流动相A；16.0～18.0 min，95%流动相A。

1.3.5 质谱条件

电离方式：电喷雾电离（elaectrospray ionization，ESI）源正离子模式（ESI+），离子化电压4 500 V，离子源温度550 ℃，气帘气压力40 psi（275.8 kPa），喷雾气压力（GAS1）55 psi（379.225 kPa），辅助加热气压力（GAS2）55 psi（379.225 kPa）。扫描模式：采用多反应监测模式采集数据，具体参数如表1所示。

表 1 6 种农药的质谱测定条件Table 1 Mass spectrometric conditions for analysis of six pesticides

1.3.6 基质效应计算

通过空白基质配制1 μg/L和10 μg/L的标准工作液，峰面积记为A1，用复溶液配制相同质量浓度的标准工作液的峰面积记为A2，基质效应按下式计算。

1.4 数据处理

采用SCIEX Qtrap 5500 MultiQuant数据定量处理软件分析数据，并将数据导出后用Office Excel 2007进行表格绘制和制图。

2 结果与分析

2.1 样品提取剂的选择

分别选择1%乙酸-乙腈、1%甲酸-乙腈、乙腈作为提取溶剂，比较6 种农药残留的提取效果。相关报道认为，乙腈能溶解多种无机、有机物质，且在液相色谱-质谱检测实验中是干扰最小的一种溶剂[24]，本研究结果也验证了这一结论，从干扰杂峰来看，加入一定量的乙酸和甲酸对实验结果并没有太大的改善，乙腈作为提取溶剂时杂峰和干扰峰最少，且提取的回收率也最佳，6 种农药的回收率为85.1%～96.1%，如图1所示，因此采用单一乙腈溶液对样品进行提取。

2.2 样品净化方法的选择

牛乳经过萃取后存在如脂肪酸、酚类和碳水化合物等杂质，需要采用一定手段和技术对其进行净化处理后，才能有效检测农药残留。本研究比对市面上多种净化包的特性和成分，针对牛乳中含有的糖类和脂肪酸，选择合适的吸附剂去除干扰物质，且不影响回收率，经过筛选，选择石墨化炭黑、C18和PSA作为固相萃取材料进行处理。结果表明，含有PSA成分的净化包净化效果最理想，回收率最佳。石墨化炭黑主要是针对有色物质的去除效果较好，而C18的净化效果、峰形和基线没有采用PSA的净化效果理想，并且由于PSA含有叔胺基团，有比氨基柱更强的离子交换能力，可有效去除有机酸、色素和金属离子。所以，确定采用含有PSA成分的净化包进行处理。

2.3 复溶液的选择

参考GB/T 23211—2008《牛奶和奶粉中493 种农药及相关化学品残留量的测定 液相色谱-串联质谱法》[25]，根据流动相选择60%乙腈、20%甲醇、20%乙腈、5%甲酸-乙腈溶液为复溶液，对比这几种复溶液对色谱峰的峰形和响应值的影响。结果表明，5%甲酸-乙腈溶液作为复溶液，6 种农药残留峰形及响应值均优于其他3 种复溶液，可能是由于该复溶液更接近于流动相的比例。

2.4 色谱柱的选择

根据GB/T 23211—2008[25]，本研究考察安捷伦ZORBAX SB-C18色谱柱和Poroshell 120 EC-C18色谱柱（2.1 mm×100 mm，2.7 µm）对6 种农药残留的分离效果。结果表明，Poroshell 120 EC-C18色谱柱能实现6 种农药残留的同时有效分离，色谱峰形好，灵敏度高，因此选择Poroshell 120 EC-C18色谱柱作为分离柱，并优化了进样量、流动相梯度条件。

2.5 流动相的选择

根据GB/T 23211—2008[25]和参考文献[26]，首选0.1%甲酸-乙腈作为流动相，同时比较甲醇、乙腈、乙腈-甲酸、甲醇-乙酸铵、乙腈-乙酸铵溶液为流动相对峰形的影响。结果表明，由于6 种物质均为正离子模式下检测，单纯使用甲醇溶液及乙腈溶液作为流动相，杀线威、嘧菌酯出现峰前延现象，噻虫胺和吡虫啉色谱峰变宽，灭多威出现峰拖尾现象，当水相中加入一定量的甲酸后，峰形尖锐、对称；而使用甲醇-乙酸铵和乙腈-乙酸铵溶液作为流动相时，噻虫啉、灭多威和杀线威的峰形较差，均有前延现象。综合考虑分离效果、峰形及准确度等因素，最终选择0.1%甲酸-乙腈溶液作为流动相，并采用确定好的色谱条件，可以使6 种农药残留达到较好的分离效果。添加质量浓度为5 ng/mL时6 种目标化合物的总离子流色谱图如图2所示。

2.6 基质效应实验

基质效应大于100%有较强的基质效应，小于100%有基质抑制作用，不利于其电离[27]。分别做6 次重复测定，结果取平均值。由表2可知，6 种农药均有不同程度的基质抑制效应，因此使用空白基质绘制标准曲线进行定量来补偿基质效应引起的响应变化。

表 2 样品的基质效应Table 2 Matrix effects of samples %

2.7 标准曲线、检出限和定量限

由表3可知，各标准曲线的相关系数均大于0.995。牛乳中多菌灵、杀线威、灭多威、噻虫胺、吡虫啉和嘧菌酯的检出限均为0.1 μg/kg，其信噪比（RS/N）均满足≥3的要求，定量限均为1.0 μg/kg，其RS/N均满足≥10的要求，可以满足GB/T 27404—2008《实验室质量控制规范 食品理化检测》[28]要求。

表 3 标准曲线、检出限和定量限Table 3 Analytical figures of merit of the proposed method

2.8 加标回收率和精密度

选取市售牛乳样品进行加标回收率实验，参考夏卫东等[26]研究，分别选3 个添加水平，加标量分别为1.0、2.5、5.0 μg/kg，每个加标量分别做6 次平行实验，用基质标准曲线进行定量。由表4可知，6 种农药的加标回收率为76.5%～113.7%，相对标准偏差均小于6.1%，说明该方法具有良好准确度和精密度，符合方法学要求。

表 4 牛乳中6 种农药残留的加标回收率和精密度测定结果（n=6）Table 4 Recoveries and precision RSDs of six pesticides spiked into blank milk sample (n = 6)

3 结 论

本研究利用QuEChERS技术，建立了一种牛乳中6 种农药残留的超高效液相色谱-串联质谱检测方法，对前处理、净化方式及色谱条件进行优化。结果表明，采用乙腈作为提取剂，盐包吸水，净化包除杂，体积分数0.1%甲酸-乙腈为最佳流动相，与GB/T 23211—2008方法相比，前处理步骤简单，检出限（0.1 μg/kg）均低于国标方法；标准曲线的相关系数均大于0.995，6 种农药的平均加标回收率为76.5%～113.7%，相对标准偏差为1.5%～6.1%。该方法有效节约了成本和时间，能一针进样，快速、简便、准确同时检测6 种农药残留含量，提高了检测效率，特别有利于乳品企业内部实现大批量检验与应用，为食品安全提供了服务和保障。