液相色谱法测定超高温灭菌乳中蛋白含量

兰 丽，张彩霞，高万东，余志宝，徐 红，唐振鑫，范 敏，杨明阳，田加美，张雪娇，张 晶，贺晓鸣，郭素芳

（内蒙古伊利实业集团股份有限公司，内蒙古 呼和浩特 010110）

牛乳蛋白质是人体优质的食物蛋白来源，乳蛋白的深入研究是行业良性发展的必然需求。牛乳的主要蛋白成分为酪蛋白与乳清蛋白，其中，酪蛋白包括α-、β-、κ-酪蛋白，乳清蛋白包括α-乳白蛋白、乳铁蛋白、β-乳球蛋白、牛血清白蛋白、免疫球蛋白（IgG、IgA、IgM）等[1-3]，有些蛋白成分含量与产品组织状态密切相关，而传统的凯氏定氮法只能通过总氮含量间接测定蛋白质的含量，已无法满足特性蛋白的检测需求。因此，建立合理、稳定的乳蛋白评价方法对乳质量评价具有重要意义。

目前有关乳制品中蛋白质分析的方法有毛细管电泳法[4-5]、免疫学方法[6-7]、平板凝胶电泳法[8-9]、液相色谱法[10]、核磁共振磷谱法[11]、液相色谱-质谱法等[12-15]，就目前检测A2β-酪蛋白的液相色谱-质谱法而言，其主要基于酶解后的肽段含量来测定蛋白，不能直接反应蛋白含量的变化。基于检测成本及设备考量，建立一种能一次性进样并满足超高温（ultra high temperature，UHT）灭菌乳中α-酪蛋白、β-酪蛋白、κ-酪蛋白、α-乳白蛋白、β-乳球蛋白的液相色谱检测法，监测UHT乳中蛋白含量，旨在为后续工艺改善、生产过程控制提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

市售强化A2β-酪蛋白系列牛乳；市售普通UHT灭菌乳。

β-酪蛋白标准品（纯度≥98.0%）、κ-酪蛋白标准品（纯度≥70.0%）、α-酪蛋白标准品（纯度≥70.0%）、β-乳球蛋白标准品（纯度≥90.0%） 美国Sigma公司；α-乳白蛋白标准品（纯度≥85.0%）、三氟乙酸（质谱级） 德国CNW公司；双[三(羟甲基)氨基甲烷]（BisTris） 上海源叶生物科技有限公司；盐酸胍上海泰坦化学有限公司；柠檬酸钠 天津福晨化学试剂有限公司；二硫苏糖醇 河北百灵威超精细材料有限公司；乙腈（色谱纯） 成都市科隆化学品有限公司。

1.2 仪器与设备

1260液相色谱仪（配备紫外检测器） 美国安捷伦有限公司；Biofuge Stratos低温高速离心机 德国Sigma公司；KS501涡旋振荡器 德国IKA公司；MILLI-Q超纯水机 美国Millipore公司；分析天平（十万分之一）瑞士Mettler Toledo公司。

1.3 方法

1.3.1 溶液配制

溶液Ⅰ：称取2.092 4 g BisTris、57.318 g盐酸胍、0.157 g柠檬酸钠、0.300 79 g二硫苏糖醇，置于容量瓶中，加水定容至100 mL（含0.1 mol/L BisTris、6 mol/L盐酸胍、5.37 mmol/L柠檬酸钠、19.5 mmol/L二硫苏糖醇），现用现配。

溶液Ⅱ：称取42.988 5 g盐酸胍，加入100 μL三氟乙酸，用水定容至100 mL（含体积分数0.1%三氟乙酸、4.5 mol/L盐酸胍），现用现配。

1.3.2 标准溶液配制

β-酪蛋白工作液配制：用天平（十万分之一）分别称取0.001 00、0.002 00、0.005 00、0.010 00、0.015 00 gβ-酪蛋白标准品于10 mL离心管中，各加400 μL超纯水。κ-酪蛋白工作液配制：用天平（十万分之一）分别称取0.001 00、0.002 00、0.005 00、0.010 00、0.015 00 gκ-酪蛋白标准品于10 mL离心管中，各加400 μL超纯水。α-酪蛋白工作液配制：用天平（十万分之一）分别称取0.001 00、0.002 00、0.005 00、0.010 00、0.015 00 gα-酪蛋白标准品于10 mL离心管中，各加400 μL超纯水。α-乳白蛋白工作液配制：用天平（十万分之一）分别称取0.001 00、0.002 00、0.005 00、0.010 00、0.015 00 gα-乳白蛋白标准品于10 mL离心管中，各加400 μL超纯水。β-乳球蛋白工作液配制：用天平（十万分之一）分别称取0.001 00、0.002 00、0.005 00、0.010 00、0.015 00 gβ-乳球蛋白标准品于10 mL离心管中，各加400 μL超纯水。

1.3.3 样品测定

1.3.3.1 试样制备与处理

吸取400 μL牛乳，加入400 μL溶液Ⅰ，涡旋混匀，室温静置1 h，将混合溶液12 000 r/min、4 ℃离心10 min，用枪头将表层乳脂移开，吸取底层溶液300 μL于新的离心管中，加入900 μL溶液Ⅱ，涡旋混匀，用0.45 μm水相滤膜过滤待测[16-18]。

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1.3.3.2 标准工作液处理

将制备好的标准工作液中加入400 μL溶液Ⅰ，涡旋混匀，室温静置1 h，将混合溶液12 000 r/min、4 ℃离心10 min，吸取溶液300 μL于新的离心管中，加入900 μL溶液Ⅱ，涡旋混匀，用0.45 μm水相滤膜过滤待测。

1.3.3.3 液相色谱条件

色谱柱：菲罗门-Venus C18（300 Å，4.6 mm×250 mm，5 μm）；流动相：流动相A为体积分数0.1%三氟乙酸-乙腈溶液，流动相B为体积分数0.1%三氟乙酸，梯度洗脱；流速0.7 mL/min；柱温30 ℃；进样量10 μL；检测波长214 nm；梯度洗脱程序如表1所示[16,19]。

表 1 流动相梯度洗脱条件Table 1 Mobile phase composition for gradient elution

1.3.4 结果计算

试样中蛋白含量按下式计算。

待测试样蛋白质量浓度测定方法：测定5 个系列质量浓度的各蛋白标准溶液，以各蛋白质量浓度（mg/mL）为横坐标（x），对应峰面积为纵坐标（y），绘制标准曲线，得到各蛋白线性方程及相关系数，将样品峰面积代入曲线，得到相应质量浓度。

对于含有不同亚型的蛋白（如κ-酪蛋白、β-酪蛋白、β-乳球蛋白），采取峰面积占比形式计算各亚型含量。

1.4 数据处理

运用Agilent ChemStation仪器数据分析软件和Excel软件对图谱和数据进行处理。

2 结果与分析

2.1 前处理方法的确定

为了选择合适的前处理方法，本研究对国内外目前乳制品中蛋白的液相色谱法测定进行分析，一般包括2 种方法，一是基于等电点沉淀提取酪蛋白，洗涤沉淀进行检测。刘梦云等[10]运用此方法进行乳粉中酪蛋白的定量检测。二是基于用尿素、盐酸胍、二硫苏糖醇、柠檬酸钠、乙二胺四乙酸二钠等试剂破坏酪蛋白胶束，打开蛋白二硫键等方式，使蛋白变性，检测蛋白含量。王浩等[20]运用此种方法对乳制品进行定量分析，分离出7 种主要蛋白成分（包括酪蛋白）。豆剑伟等[21]运用此方法对3 种酪蛋白标准品进行分离。Bonfatti等[22]运用此方法对水牛乳蛋白组分和遗传变异体进行分离和定量。

基于等电点沉淀提取酪蛋白的方式较为复杂，且不能同时检测乳清蛋白。经过研究，结合实际实验操作，选择盐酸胍和二硫苏糖醇等搭配无机盐配制缓冲溶液进行实验，可以充分溶解蛋白质，展开蛋白质空间结构，且操作简单、耗时短。

2.2 各蛋白标品谱图

通过单标及曲线线性确定蛋白保留时间。由图1～5可知，各蛋白具有较好的分离度，β-酪蛋白包含3 个变异体，依据出峰次序依次为B型、A1型、A2型β-酪蛋白，κ-酪蛋白包含3 个变异体，依据出峰次序依次为κ1型、κ2型、κ3型κ-酪蛋白，β-乳球蛋白包含2 个变异体，依据出峰次序依次为B型、A型β-乳球蛋白。

2.3 标准曲线及相关系数

参照GB/T 27404—2008《实验室质量控制规范 食品理化检测》附录F“检测方法确认的技术要求”，对于确证方法，相关系数不应低于0.99。由表2可知，各蛋白线性方程相关系数（r）为0.995以上，能满足检测要求。基于满足信噪比（RS/N）≥3的要求，得出检出限。

表 2 各蛋白亚型的标准曲线拟合方程及检出限Table 2 Calibration curve equations and detection limits for milk proteins

需要特别强调的是，β-酪蛋白标准品、κ-酪蛋白标准品、α-酪蛋白标准品纯度无法达到100%，例如，β-酪蛋白标准品的色谱带会含有少量κ-酪蛋白，故实验时，β-酪蛋白、κ-酪蛋白、α-酪蛋白曲线绘制时标准溶液需要单独配制，不能配制混标。

2.4 样品检测谱图

分别对市售普通UHT乳及A2β-酪蛋白牛乳运用上述方法进行检测。由图6～7可知，在保留时间30.0 min处为β-酪蛋白，普通UHT乳β-酪蛋白处有3 个峰，分别为B型、A1型、A2型，A2β-酪蛋白牛乳保留时间31.5 min处只有A2型β-酪蛋白，该方法可以对此类灭菌乳鉴定提供检测手段。

2.5 各蛋白加标回收率（准确度）

在待测样品中加入一定量的标准样品，混合均匀后，按照相同的检验方法进行测定，比较加入标准样品后的含量和理论加标量，计算加标回收率。

参照GB/T 27404—2008附录F“检测方法确认的技术要求”，样品中被测组分含量大于100 mg/kg时，回收率为95%～105%，本研究测定的各蛋白含量均大于100 mg/kg。由表3可知，样品6 次加标实验的回收率为95.2%～105.0%，能满足检测要求。

表 3 市售UHT乳各蛋白的加标回收率Table 3 Recoveries of milk proteins spiked into commercially available UHT milk

2.6 方法精密度

重复性是指在重复性条件下所测得的相互独立的实验结果之间的符合程度。重复性条件是指在同一实验室内，由同一操作者使用新建色谱定量分析方法，在较短时间间隔内使用同一仪器对相同样品进行分析测定。

参照GB/T 27404—2008附录F“检测方法确认的技术要求”，样品中被测组分含量≤1%，变异系数≤2.7%。本研究测定的蛋白含量＜1%，由表4可知，6 次重复性实验的相对标准偏差为0.78%～2.70%，能满足检测要求。

表 4 各蛋白平行测定结果及相对标准偏差（n=6）Table 4 Results and relative standard deviations of determination of milk proteins (n = 6)

2.7 样品测定及不同方法间测定结果比较

运用本研究的液相色谱法对市售A2β-酪蛋白牛乳样品进行检测，结果如表5所示；同时，运用高效液相色谱-质谱法[12-13]对市售3 批次A2β-酪蛋白牛乳中的A2型β-酪蛋白进行货架期跟踪监测，以进行结果比较，结果如表6所示。

表 5 某市售A2β-酪蛋白牛乳不同放置时间各蛋白含量测定结果（液相色谱法）Table 5 Contents of κ-casein, β-casein, α-lactalbumin and β-lactoglobulin in commercial A2 β-casein-fortified milk stored for different periods determined by the LC method g/100 mL

表 6 市售3 批A2β-酪蛋白牛乳中A2型β-酪蛋白含量检测结果（高效液相色谱-质谱法）Table 6 Contents of A2 β-casein-fortified in three lots of commercial A2 β-casein-fortified milk determined by HPLC-MS g/100 mL

目前，检测牛乳蛋白分型无国标方法，检测A2β-酪蛋白也没有国标及行标方法，公认较为准确的方法为液相色谱-质谱法，质谱检测技术的引入使得蛋白质分析得到重大改进[23-24]。由表5～6可知，放置60 d样品，液相色谱法检测结果与高效液相色谱-质谱法检测结果接近，液相色谱法检测结果随放置时间延长有轻微降低现象，高效液相色谱-质谱法检测结果无此变化趋势，这可能是由于乳蛋白发生糖基化[25-26]，液相色谱法无法检测糖基化蛋白或由于乳中固有酶类[27-28]导致蛋白结构发生变化，使得液相色谱法无法检出，原因还需进一步研究分析。在实际运用过程中，液相色谱法可以进行蛋白分型检测，此方法可以实现UHT乳中的α-酪蛋白、β-酪蛋白、κ-酪蛋白、α-乳白蛋白、β-乳球蛋白的一次性检测并定量，操作方法简单，试剂廉价易得，设备易于推广，但只适用于UHT乳较短贮藏期内的蛋白含量监测，且单次分析时间较长，高效液相色谱-质谱法通过特异性肽段建立标准曲线对蛋白进行定量，方法较为精准，但每种蛋白的特异性肽段不同，依据蛋白特性检测的前处理可能不同，实现几种蛋白的共同检测需要进一步研究，且肽段需要人工合成，肽段纯度定量较为困难，试剂成本昂贵，对操作人员要求较高，且设备不易推广。

3 结 论

明确乳制品中蛋白质的组分和含量是评价乳制品营养价值、致敏特性等的基础，本研究提供了一种液相色谱方法检测UHT乳中的蛋白含量，方法简便，易于推广，为企业工艺改善研究、新产品研究或监测产品中蛋白含量提供了一种检测手段。