高效液相色谱串联质谱法测定葡萄中精甲霜灵、吡唑醚菌酯、氰霜唑及其代谢物CCIM残留

黄 鑫，贾福艳，刘良月，关 鑫，杨沛文，郭红霞，张 双，杨雪葳，黄成田*

(1.沈阳沈化院测试技术有限公司，辽宁 沈阳 110021；2.沈阳化工研究院有限公司，辽宁 沈阳 110021)

1 前言

精甲霜灵，又名为高效甲霜灵，对瓜果、蔬菜上的疫病、霜病毒，烟草黑胫病、辣椒霜霉病等病害防治效果明显[1-4]。现阶段，对精甲霜灵残留量的报道主要集中于烟叶、番茄、马铃薯、人参、葡萄、黄瓜等[5-8]，分析方法多为液相色谱法和气相色谱法，未见精甲霜灵在液相色谱串联质谱上的分析报道。我国GB2763-2021规定精甲霜灵的残留物定义为甲霜灵。

吡唑醚菌酯，又名唑菌胺酯，是具有杀菌谱广、活性高、持效期长、毒性低、对非靶标生物安全的杀菌剂[9]，对于真菌性病害如锈病、叶枯病、霜霉病、白粉病等有很好的防治效果，其作用机理是干扰细胞间能量的供给，造成细胞中能量不足，进而起到杀菌的作用[10]。

氰霜唑，化学名称为4-氯-2-氰基-N，N-二甲基-5-对甲苯基咪唑-1-磺酰胺，对霜霉病、疫病如黄瓜霜霉病、葡萄霜霉病、番茄晚疫病、马铃薯晚疫病等有极高的抑制活性。氰霜唑在使用后会迅速分解，主要降解产物为CCIM[11]。我国GB2763-2021规定氰霜唑的残留物定义为氰霜唑和代谢物CCIM之和。

目前，尚未见同时检测葡萄中精甲霜灵、吡唑醚菌酯、氰霜唑及其代谢物CCIM的残留分析方法。本文建立了采用高效液相色谱-串联质谱同时测定葡萄中精甲霜灵、吡唑醚菌酯、氰霜唑和CCIM的残留分析方法，方法选择性好，回收率高，分析时间短，适合葡萄中精甲霜灵、吡唑醚菌酯、氰霜唑及其代谢物CCIM的痕量分析。

2 试验部分

2.1 仪器和试剂 岛津LC-AD高效液相色谱(日本岛津公司)-质谱联用仪(API4500QTrap，美国AB公司)；电子分析天平(0.000 1g和0.01g，赛多利斯)；回旋振荡器HY-5(常熟国华电器有限公司)；超纯水机(美国密理博公司)。

乙腈(色谱纯，Fisher)；乙酸(分析纯，西陇化工有限公司)；甲酸(色谱纯，Fisher)；PSA(40-60μm，60Å，博纳艾杰尔科技有公司)；C18(50μm，60Å，博纳艾杰尔科技有限公司)；氯化钠(分析纯，西陇化工有限公司)。

甲霜灵标准品：纯度98.5%；吡唑醚菌酯标准品：纯度98.0%；氰霜唑标准品：纯度99.2%；CCIM标准品：纯度99.3%。

2.2 样品前处理 称取10.00g(±0.01g)粉碎后的空白葡萄样品于150mL三角瓶中，加入50mL乙腈(含1%乙酸)，振荡提取30min，再加入约6g氯化钠，旋涡混匀约30s，静置分层后，取2.00mL乙腈层，加入100mg PSA、50mg C18净化，漩涡混匀约30s，过0.22μm有机滤膜，待HPLC-MS/MS检测。

2.3 仪器分析条件

2.3.1 液相色谱条件 液相色谱柱：Waters Acquity UPLC C1850mm×2.1mm ，1.7μm；柱温：40℃；流速0.4mL/min；进样体积：10.0μL；流动相：0.1%甲酸水(A)和0.1%甲酸乙腈(B)。

表1 流动相梯度洗脱参数

2.3.2 质谱条件 电离源模式：电喷雾离子源；扫描方式：正离子；离子源电压：4500V；离子源温度：450℃；EP电压：10V；CXP电压：9V。

2.4 标准溶液的配制 储备液配制：分别称取甲霜灵标准品0.025 38g，氰霜唑标准品0.025 20g，吡唑醚菌酯标准品0.025 51g，CCIM标准品0.025 18g于25mL容量瓶中，用乙腈溶解定容至刻度线，配得浓度均为1 000mg/L储备液，于-4℃避光保存。

标准溶液配制：分别用乙腈和葡萄空白基质配制0.001、0.002、0.005、0.01、0.02、0.05和0.1mg/L的系列混合标准工作溶液，用于考察基质效应。

2.5 添加回收率试验 取空白葡萄样品，加入一定量的甲霜灵、吡唑醚菌酯、氰霜唑及其代谢物CCIM混合标准溶液，在0.01、0.1和1.0mg/kg 3个水平下进行添加回收试验，每个水平设置5个重复。经2.2处理后测定，计算回收试验的回收率和相对标准偏差。

3 结果与讨论

3.1 HPLC-MS/MS条件选择

3.1.1 质谱条件优化 分别配制质量浓度为0.1mg/L的甲霜灵、吡唑醚菌酯、氰霜唑和CCIM的标准溶液，首先在Q1 SCAN模式下分别进行了正离子扫描和负离子扫描，发现正离子扫描信号强度较高，因而选择正离子扫描，确定4种化合物的母离子。然后在Product Ion Scan模式下得到高质量的MS2图，确定化合物的子离子。最后根据前面选出的母离子、子离子，组件MRM离子对，优化CE和DP。最终优化好的质谱参数(表2)，标准溶液谱图(图1)。

表2 质谱参数

图1 甲霜灵标准溶液(0.1mg/L)(a)；吡唑醚菌酯标准溶液(0.1mg/L)(b)；氰霜唑标准溶液(0.1mg/L)(c)；CCIM标准溶液(0.1mg/L)(d)

3.1.2 液相条件优化 本试验选择Waters Acquity UPLC C1850mm×2.1mm，1.7μm和Agilent Extend C1850mm×4.6mm，3.5μm两种色谱柱进行峰型和响应比较，发现1.7μm优于3.5μm。

分别选择乙腈：水、乙腈：0.1%甲酸水、0.1%甲酸乙腈：0.1%甲酸水3种不同的流动相进行梯度洗脱，发现乙腈：水作为流动相时CCIM有拖尾的现象，乙腈：0.1%甲酸水、0.1%甲酸乙腈：0.1%甲酸水作为流动相时4种化合物峰型较好，且0.1%甲酸乙腈：0.1%甲酸水作为流动相时4种化合物均获得较高的响应，因此选择0.1%甲酸水和0.1%甲酸乙腈作为流动相进行梯度洗脱。

3.2 前处理条件选择 通常根据化合物的理化性质和样品成分来选择提取溶剂。依据相似相溶原理，本试验先选择了乙腈作为提取溶剂，发现CCIM的回收率偏低，不能满足回收率要求。然后选择甲醇进行提取，4种农药回收率均能满足要求，但葡萄样品糖分含量较高，杂质较多，甲醇提取范围较大，提取出的提取液杂质也较多。而向乙腈提取液中加入乙酸后，4种农药的回收率均能满足要求，且提取液较干净，因此最后选择1%乙酸乙腈作为提取溶剂。

3.3 基质影响评价 分别用乙腈、空白葡萄提取液配制甲霜灵、吡唑醚菌酯、氰霜唑和CCIM的系列混合标准溶液，按照先后顺序进行检测，并分别制作标准曲线，通过比较斜率的偏差，评价基质的影响，结果(表3)。甲霜灵、吡唑醚菌酯、氰霜唑和CCIM在葡萄中的基质效应均为弱基质效应。因此我们在检测葡萄中甲霜灵、吡唑醚菌酯、氰霜唑和CCIM时，可选择乙腈配制系列工作溶液。

表3 葡萄中甲霜灵、吡唑醚菌酯、氰霜唑和CCIM的基质效应

3.4 方法的线性、回收率、精密度 分别以甲霜灵、吡唑醚菌酯、氰霜唑和CCIM的质量浓度为横坐标(x)，以对应的峰面积为纵坐标(y)作图，结果表明，甲霜灵、吡唑醚菌酯、氰霜唑和CCIM在0.001～0.1mg/L范围内线性良好，相关系数r均>0.99。

4种农药在葡萄基质中分别进行3个水平的添加回收率实验，每个处理重复5次。采用外标法定量，甲霜灵在葡萄中的平均回收率为84%～86%，RSD为1.3%～3.8%，吡唑醚菌酯在葡萄中的平均回收率为89%～92%，RSD为2.2%～3.8%，氰霜唑在葡萄中的平均回收率为87%～89%，RSD为5.2%～6.7%，CCIM在葡萄中的平均回收率为83%～91%，RSD为3.8%～5.4%，甲霜灵、吡唑醚菌酯、氰霜唑和CCIM在葡萄中残留检测方法的定量限(LOQ)均为0.01mg/kg，符合农药残留分析方法要求[12]。

表4 葡萄中添加回收试验(n=5)

4 结论

本文建立了一种能够同时简便、快速、准确检测葡萄样品中精甲霜灵、吡唑醚菌酯、氰霜唑及其代谢物CCIM的残留分析方法。该方法前处理简单、分析时间短、仪器选择性高，满足样品残留分析的要求，适用于葡萄中精甲霜灵、吡唑醚菌酯、氰霜唑及其代谢物CCIM的残留检测。