氨基酸/氧化石墨烯/羟基磷灰石复合材料在酸蚀人牙釉质体外再矿化中的应用

蔡 英，钏定泽，陈庆华，刘继涛

(1.云南白药集团健康产品有限公司，昆明 650217；2.昆明理工大学材料科学与工程学院，昆明 650093)

0 引 言

成熟的人牙釉质(human enamel, HE)是一种高度矿化的组织，由95%～97%的无机矿物质组成[1]。无机矿物质主要由羟基磷灰石(HA)晶体组成[2]，这种HA晶体呈六角晶柱状，平行排列且垂直于牙釉质表面，形成纳米级HA棱柱结构[3]。正常情况下，HE是一种相对稳定的结构，脱矿和再矿化处于动态平衡状态。然而，当这种平衡被破坏后，会使牙釉质脱矿[4]并可能生成早期龋齿。

临床上针对早期釉质龋，主要采用氟化物进行再矿化治疗。但氟化物过量会导致氟斑牙、氟骨症、急性氟中毒等毒副作用[5-6]。仿生牙釉质再矿化是一种新的、现代的早期龋齿治疗方法[7]。釉原蛋白、PAMAM树枝状大分子、壳聚糖[8-9]、Tuftelin衍生肽[10]、自组装肽P11-4[11]等新型材料，都能诱导牙釉质仿生再矿化，在牙釉质表面生成HA晶体。但这些材料存在很多复杂多变的问题，不利于后续临床应用工作的开展。HA具有与牙齿硬组织相似的矿物质含量，具有较高的生物活性和生物相容性[12]。单独应用HA材料进行牙釉质再矿化，主要利用其纳米尺寸效应填充脱矿部位，因此对牙釉质龋损的再矿化作用有限。

在成釉细胞介导的牙釉质无机-有机生物矿化过程中，多种蛋白质成分起到了关键作用。同时，成熟牙釉质中的少量蛋白质残留物，赋予其惊人的结构力学性能[13]。这些蛋白质残留物的氨基酸(AA)组成主要以甘氨酸(Gly)、谷氨酸(Glu)、天冬氨酸(Asp)等含量最高[14]，Linden等[15]发现，牛牙釉质表层下蛋白质在脱矿过程中丢失的氨基酸主要为Gly、Glu、Asp等，丢失的这类AA可能在矿化过程中参与了HA晶体的定向生长过程[16]。Li等[17-18]研究证明，Glu和Asp能够吸附在酸蚀釉质晶体表面，定向排列束状类釉质晶体层。刘继涛等[19]研究发现，Glu、丝氨酸(Ser)和Asp复合改性HA材料对酸蚀牛牙釉质体外再矿化的修复效果较好。

氧化石墨烯(GO)具有比表面积大、分散性好、可生物降解、层间嵌有丰富含氧基团(如羟基、羧基和环氧基团)的特性，这些含氧官能团使GO很好地分散在水溶液中，可与金属离子或纳米粒子结合[20-22]。刘继涛等[23]研究发现，GO改性HA复合材料具有良好的生物相容性，应用于酸蚀牛牙釉质体外再矿化，可使深层脱矿的釉质得到良好修复，并促进了脱矿釉柱间隙中有序排列晶体的生成。

本文在课题组前期研究的基础上，采用化学均相沉淀法，制备了Gly/GO/HA、Asp/GO/HA复合材料和不含改性成分的HA。对复合材料的细胞毒性进行测试，考察其对酸蚀人牙釉质体外再矿化的影响，并讨论不同复合材料的再矿化机制。

1 实 验

1.1 实验材料

氨水，分析纯，广东光华科技股份有限公司；NaN3，分析纯，福晨(天津)化学试剂有限公司；去离子水，自制；其他试剂均为分析纯，国药集团化学试剂有限公司。

1.2 复合材料的制备

本文设计了3组实验材料，1组为不含AA和GO的HA对照组，2组为含30 mmol/L的Gly和0.05%(质量分数)GO的Gly/GO/HA，3组为含30 mmol/L的Asp和0.05%GO的Asp/GO/HA。将Ca(NO3)2·4H2O(14.169 g，60 mmol)和对应浓度的AA/GO溶解于1 600 mL去离子水中，超声分散至无可见GO颗粒，得到浅黄色透明溶液。将混合物加热，并在实验过程中保持(37±1)℃。将(NH4)2HPO4(4.752 g，35.98 mmol)溶于800 mL去离子水中，在约120 min内缓慢地滴定到前述混合物中。用2.5%的NH3·H2O调节溶液的pH值，使其在反应过程中保持在10±0.5。完成滴定后，保温继续反应24 h，然后在常温下静置陈化24 h，用去离子水洗涤至pH值约为7.0，最后将沉淀物过滤、冷冻干燥即得以上3组实验材料。

1.3 HE样品和龋损的制备

据中国人民解放军联勤保障部队第920医院的标准程序，收集因正畸而拔除的18～45岁人群的第三磨牙。选用完整并且没有龋损的人牙，用刀片去除牙齿表面的有机污物并切下根部，再用DTQ-5低速精密切割机切成长宽厚约为4 mm×3 mm×2 mm的釉质块，用PMMA包埋釉质块，在水冷金刚砂盘上将暴露的釉质唇抛光为镜面状表面，用体视显微镜检查无明显划痕。处理好的釉质块超声处理1 min，浸入含有0.1 mol/L乳酸和3%羧甲基纤维素的乳酸脱矿凝胶中(pH=4.0)，使釉质的表面积与溶液的比率为2 mm2/mL，置于37 ℃恒温箱中进行脱矿处理12 h，再用去离子水反复冲洗样品并进行超声处理1 min，处理好的样品储存在4 ℃的PBS中备用。

1.4 CCK-8法测定细胞毒性

采用CCK-8法，测定上述所制备材料对第3代293T细胞的毒性。制备浓度为0.05～0.4 g/mL的待测材料浸提液，与密度为5.0×104个/孔的293T细胞共同培养48 h，然后将10 μL CCK-8溶液加入到每个孔中，继续温育4 h，在波长为450 nm下测量每个孔的光密度(OD)。相对细胞活性(RCV)按以下公式计算：

(1)

式中：ODt、ODn和OD0分别为含有材料浸提液的孔，不含材料的孔(阴性对照)和没有细胞的孔(空白对照)的平均光密度值。每种浓度材料测量8个孔的OD值，使用平均值±标准偏差表示。

1.5 HE样品表征

脱矿HE样品的再矿化方法和流程与课题组已发表文章[23]相同。采用配备EDX能谱的FEI Nova NanoSEM 450型场发射扫描电镜表征HE的表面和剖面形貌及表面元素组成。采用PANalytical Empyrean型X射线衍射仪测定HE表面成分结构，测试条件为如下：Cu Kα(λ=0.154 06 nm)，扫描角度2θ=20°～70°，步长0.02°，电流40 mA，电压40 kV。采用THV-30MD型显微硬度仪，测定9.8 N载荷下HE样品表面显微硬度(SMH)，保荷时间为15 s。测定3个时间点(脱矿前MH0、脱矿后MH1和再矿化后MH2)，测量样品表面间距200～300 μm的三个点并计算平均值。将HE样品的SMH按从大到小排列，根据平衡分布原理将样品均匀分为3组(n=6)。

2 结果与讨论

2.1 复合材料的细胞毒性分析

图1为HA、Gly/GO/HA和Asp/GO/HA的细胞毒性对比图。参照GB/T 16886.5—2017《医疗器械生物学评价 第5部分：体外细胞毒性试验》，不含AA/GO的HA在测试浓度范围内，细胞毒性为0级或1级；Gly/GO/HA和Asp/GO/HA的细胞毒性均为0级。与刘继涛等[23]制备的GO/HA复合材料相比，AA分子的引入显著提高了复合材料的细胞相对活性(RCV)值，表明AA/GO复合改性HA具有较高的安全性和生物相容性。

图1 复合材料对细胞相对活性的影响Fig.1 Effect of the composites on relative cells viability

2.2 HE表面形貌分析

图2为再矿化前/后HE表面的FESEM照片。由图2(a)可知，抛光HE表面密实完整。经酸蚀处理后HE表面暴露出了部分的釉柱间隙，表面脱矿比较明显(见图2(b))。再矿化处理后，不含AA/GO的HA材料对酸蚀HE表面的修复作用有限，可以清晰地看出鳞片状的釉柱形貌(见图2(c))，从左下角的高倍FESEM照片可以看出，HE表面的空腔是HA利用纳米颗粒的吸附性填充的，因此在釉质表面形成了不太紧密的矿化层。图2(d)为Gly/GO改性HA复合材料处理组，HE表面生成了致密的再矿化层，并且吸附了少量的棒状晶体颗粒。图2(e)为Asp/GO改性HA复合材料处理组，HE表面形成了不连续的再矿化层，从左下角的高倍放大图可以看出，再生的晶体具有不规则的形状。综上可知，Gly/GO/HA对酸蚀HE表面的修复效果优于HA和Asp/GO/HA。出现该现象的原因可能为：Gly的引入降低了HA晶体的稳定性，使Gly/GO/HA再矿化溶液能提供更多钙离子，促进了酸蚀HE表面新的HA晶体生成，并促进新生晶体沿有利于整体表面能降低的c轴有序生长。同时，Gly/GO/HA中的GO片层具有丰富的含氧活性基团，也可以有效促进HA的成核和结晶。由于Asp带负电，对HA表面的亲和力较高，可能会抑制HA晶体的生长。此外，含Asp的Asp/GO/HA颗粒由于缺少显著的表面电荷，导致其混悬液的稳定性较差，容易沉淀至再矿化溶液底部，使其对龋损HE表面的修复效果较差。

图2 再矿化前/后HE表面的FESEM照片：(a)抛光；(b)酸蚀；(c)HA；(d)Gly/GO/HA；(e)Asp/GO/HAFig.2 Surface FESEM images of the HE before/after remineralization: (a) polished; (b) acid-etched; (c) HA; (d) Gly/GO/HA; (e) Asp/GO/HA

2.3 HE剖面形貌分析

图3为再矿化前/后HE剖面的FESEM照片。由图3(a)可知，抛光HE剖面较致密。经酸蚀处理后，HE剖面暴露出约15 μm深的釉柱间隙，并且有更多的釉质棱晶暴露出来，脱矿比较明显(见图3(b))。再矿化处理后，不含AA/GO的HA(见图3(c))对酸蚀HE深层的修复作用有限，仍可清晰看到釉柱间隙和暴露的釉质棱晶。Gly/GO/HA对HE深层脱矿的修复作用如图3(d)所示，再矿化后HE的剖面完整致密，从高倍放大图可以看出有大量细小的晶粒生成。结合图2(d)可知，在Gly/GO的协同作用下，HA复合材料对酸蚀HE表面和深层脱矿均具有良好的修复作用。Asp/GO/HA处理组见图3(e)，深层的脱矿区域仍有明显的缺陷，高倍放大图中可见许多釉质棱晶暴露出来，说明其对酸蚀HE深层的修复较差，进一步验证了2.2中的分析。

图3 再矿化前/后HE剖面FESEM照片：(a)抛光；(b)酸蚀；(c)HA；(d)Gly/GO/HA；(e)Asp/GO/HAFig.3 Cross-section FESEM images of the HE before/after remineralization: (a) polished; (b) acid-etched; (c) HA; (d) Gly/GO/HA; (e) Asp/GO/HA

2.4 HE表面元素分析

HE表面元素组成分析如表1和图4所示。由图4(a)可以看出，抛光的HE表面n(Ca)/n(P)为1.64(经验衍生的HA为1.67)，说明HE主要由结晶度良好的HA晶体组成。由图4(b)可以看出，经过12 h酸蚀处理后，HE表面n(Ca)/n(P)降为1.56，且Ca元素的占比有一定降低。由图4(c)可知，再矿化处理后，不含AA/GO的HA使n(Ca)/n(P)恢复到1.61，这一结果可能更多反映了吸附在酸蚀HE表面的HA晶体的n(Ca)/n(P)。由图4(d)和(e)可知，Gly/GO/HA和Asp/GO/HA使酸蚀HE表面的n(Ca)/n(P)分别恢复至1.59和1.57，均高于酸蚀处理后的n(Ca)/n(P)值(1.56)。说明这两种复合材料均对酸蚀HE有修复作用，前者的修复作用优于后者，与前述实验结果一致。HE表面n(Ca)/n(P)摩尔比如表1所示。

表1 HE表面Ca/P摩尔比Table 1 Ca/P molar ratio of the human enamel surface

图4 再矿化前/后HE表面EDS图谱：(a)抛光；(b)酸蚀；(c)HA；(d)Gly/GO/HA；(e)Asp/GO/HAFig.4 Surface EDS patterns of the HE before/after remineralization: (a) polished; (b) acid-etched; (c) HA; (d) Gly/GO/HA; (e) Asp/GO/HA

2.5 HE表面成分结构分析

图5为再矿化前/后HE表面的XRD图谱。图5(a)为抛光HE，图5(b)为酸蚀处理后的HE，可以看出酸蚀后釉质表面的衍射峰明显弱化，说明酸蚀会显著降低HE表面HA晶格的完整性。再矿化处理后，图5(c)、(d)和(e)的晶面衍射峰均有不同程度的恢复，说明酸蚀部位均得到了一定程度的修复。其中Gly/GO/HA处理组(见图5(d))的衍射峰强度最接近抛光牙釉质，表明Gly/GO/HA对HE表面晶体的修复作用优于HA和Asp/GO/HA。

图5 再矿化前/后HE表面XRD图谱：(a)抛光；(b)酸蚀；(c)HA；(d)Gly/GO/HA；(e)Asp/GO/HAFig.5 Surface XRD patterns of the HE before/after remineralization: (a) polished; (b) acid-etched; (c) HA; (d) Gly/GO/HA; (e) Asp/GO/HA

2.6 HE表面力学性能分析

图6为再矿化前/后HE的SMH图。经酸蚀处理后，HE的SMH均值从353.89 HV降低至约75 HV。通过单因素方差分析显示，脱矿后各实验组样品的SMH没有显著性差异(p>0.05)。尽管三组材料均使酸蚀HE的SMH得到一定恢复，且彼此之间无显著差异(p<0.05)，但仍远低于抛光HE，表明各组实验材料对HE的表面力学性能修复作用有限。HE精密的层级结构和有机物赋予的独特增韧机制[13]，使其具有高硬度、高韧性等特殊力学性能。经酸蚀处理12 h后，HE的精密层级结构可能已被酸蚀破坏，导致再矿化后HE的SMH难以恢复至正常水平。

图6 再矿化前/后HE的SMH图：(a)抛光；(b)HA；(c)Gly/GO/HA；(d)Asp/GO/HAFig.6 SMH of the HE before/after remineralization: (a) polished; (b) HA; (c) Gly/GO/HA; (d) Asp/GO/HA

3 结 论

(1)细胞毒性实验结果表明，Gly和Asp分别与GO复合改性HA，可显著提高材料浸提液的相对细胞活性，说明Gly/GO/HA和Asp/GO/HA具有较高的安全性和生物相容性。

(2)经Gly/GO/HA处理后，酸蚀HE表面及深层脱矿均得到良好修复。Gly的引入使HA沿c轴有序生长，GO片层上附着的丰富的含氧活性基团，进一步促进了HA的成核和结晶。Asp/GO/HA的再矿化效果较弱，带负电的Asp对HA表面亲和力较高，可能会抑制HA晶体的生长。此外，含有Asp的HA颗粒不易形成稳定的混悬液，使Asp/GO/HA无法有效修复酸蚀HE。

(3)HE表面元素、成分结构分析表明，Gly/GO/HA对酸蚀HE表面的修复作用优于Asp/GO/HA和HA。力学性能分析表明，各组材料对酸蚀HE的表面显微硬度修复作用有限，可能是由于新生成的矿物层缺少HE原有的精密层级结构，对其SMH值的恢复造成了一定的影响。