植物精油和胰酶对肉鸡生长性能、消化酶活性及肠道健康的影响

2022-04-13孙宪法孙宪秋蔡青和

饲料工业 2022年7期

■孙宪法周东孙宪秋王聪蔡青和*

(1.山东民和牧业股份有限公司，山东蓬莱 265600；2.上海欧耐施生物技术有限公司，上海 201606)

恩拉霉素对家禽肠道内有害梭状芽孢杆菌有很强的抑制作用，从而提高饲料中营养成分的利用率，促进增重和饲料转化率[1-2]。恩拉霉素在肉鸡中的应用效果已被业界研究所证实，但从2020 年7 月1 日起，我国禁止使用除中药外的所有促生长药物饲料添加剂，抗生素的禁用导致家禽肠道疾病高发，因此寻找抗生素的替代品刻不容缓。

植物精油（Essential oil，EO）是一类源于植物的花、叶、茎、根或果实的次生代谢产物，分子量小，在动物体内吸收代谢快、无毒无残留，具有促进动物生长、消炎杀菌及抗氧化的功效[3]。植物精油种类丰富，含有多种活性成分，对于家禽的肠道发育、消化生理、肠道免疫和微生物区系调节方面都具有良好的改善作用，是一种潜力巨大的抗生素替代品，国内外关于植物精油的研究成果快速增长，将植物精油应用在动物生产上做了很多工作，获得了很多成果[4]。酶是有活性的蛋白质，在农牧、食品、医药、生物燃料等领域广泛应用。家禽的肠道短，食糜停留时间短，内源酶作用有限，养分消化吸收不充分；家禽结肠退化，盲肠很小，盲肠微生物对非淀粉多糖（NSP）的降解能力有限，加入酶制剂可增强肠道黏膜屏障功能，改善肠道健康；钝化日粮中抗营养因子，提高养分消化率，从而减轻产气荚膜梭菌感染对肉仔鸡生长的不利。胰酶是从动物胰腺中提取的一种酶的混合物，含有胰蛋白酶、糜蛋白酶、多种肽酶、脂肪酶和淀粉酶等。刘干[5]研究表明酶制剂可以提高肉鸡生长性能，改善肠道健康。孙秋娟等[6]报道，酶制剂和植物精油组合添加可提高产气荚膜梭菌感染肉鸡的生长性状，并可降低回肠有害菌的定植，保护肠道屏障功能及组织形态结构免受产气荚膜梭菌感染的侵害，从而维持肠道健康。相关试验研究表明植物精油和胰酶均可以提高肉鸡生长性能，但植物精油和胰酶二者组合在肉鸡生产试验中未见报道。因此本试验以AA肉公鸡为研究对象，在日粮中添加不同水平的植物精油和胰酶，并进行攻毒，观察其对肉鸡生长性能、消化酶活性和肠道健康的影响。

1 材料与方法

1.1 试验材料

本试验使用的恩拉霉素为市购产品（纯度8%，DSM）；植物精油由某公司提供；胰酶（含胰蛋白酶500 U/g、胰淀粉酶2 400 U/g、胰脂肪酶3 500 U/g）由上海某生物技术有限公司提供。

1.2 试验设计

将504只AA肉公鸡分为7个处理组，每个处理分6个重复，每个重复12只。试验分两个阶段，第一阶段1～21 d，第二阶段22～42 d。具体试验设计见表1。

表1 试验设计

攻毒方案：于第14 d，用产气荚膜梭菌（CP）毒株（CVCC2030）对试验中的CP 菌感染组鸡只经口接种1 mL 菌液[（2～3）×108CFU/mL]，持续攻毒至第20 d。操作流程：将产气荚膜梭菌菌株在含有牛肉粒的灭菌疱肉培养液中37 ℃恒温过夜厌氧培养（12～14 h），用胰-亚硫酸盐-环丝氨酸（tryptose-sulfite-cycloserine，TSC）琼脂（北京陆桥技术股份有限公司）进行活菌计数，攻毒组每天每只鸡口服新鲜菌液1 mL[（2～3）×108CFU/mL]，不攻毒组肉鸡口服等量的无菌疱肉培养液。灌服用注射器或移液枪。

1.3 基础日粮

基础日粮组成及营养水平见表2。

表2 基础日粮组成及营养水平（风干基础）

1.4 饲养管理

试验于2019 年6 月在中国农业大学涿州试验基地进行。试验采用封闭式鸡舍单层笼养。按照AA肉鸡常规饲养管理程序进行管理，自由采食和饮水，按常规免疫程序进行免疫。

1.5 样品采集与制备

试验第42 d，从每个重复中随机取2只肉仔鸡宰杀，取十二指肠食糜并准确称取待测十二指肠食糜的重量，按重量（g）∶体积（mL）=1∶4的比例加入4倍体积的生理盐水，冰水浴条件下机械匀浆。将匀浆液4 ℃下2 500 r/min离心10 min，取上清液于-20 ℃保存备测消化酶活性。采集第42 d肉鸡空肠中段的1 cm肠道样品在冰磷酸盐缓冲液中清洗食糜，进行肠道炎症评分。

1.6 指标测定

1.6.1 生长性能试验的第1、21 d 和42 d 称重、结料用于计算平均体重、平均日增重（average daily gain, ADG）、平均日采食量（average daily feed intake, ADFI）和饲料转化率（feed conversion ratio, FCR）。

1.6.2 十二指肠消化酶活性

采用南京建成生物工程研究所试剂盒方法，测定42 d 肉鸡十二指肠食糜中淀粉酶（DIS）、胰蛋白酶（Tps）、糜蛋白酶（Chy）和脂肪酶（LP）活性。

1.6.3 肠道炎症评分

观察42 d肉鸡空肠肠道炎症情况并做评分，计分标准：0=无肉眼可见的损伤；1=肠壁薄或易碎（充血）；2=小的局灶坏死或溃疡；3=局灶性坏死或溃疡。

1.6.4 肠黏膜组织炎性因子mRNA表达量

刮取42 d肉鸡空肠、回肠组织肠黏膜，液氮保存，实时荧光定量PCR 测定白介素-1β（Interleukin-1β，IL-1β）、IL-2、IL-4、IL-6、IL-8、IL-10、Toll 样受体-4（Toll-like receptor4，TLR-4）、肿瘤坏死因子-α（TNFα）的mRNA相对表达量。总RNA提取按照赛默飞公司提取步骤进行，随后用核酸蛋白测定仪测定总RNA的纯度和浓度。cDNA合成采用反转录试剂盒（TaKa-Ra，大连）。采用SYBR Green Ⅱ染料法进行实时荧光定量PCR，采用美国ABI 7500 荧光定量PCR 仪进行测定，引物序列见表3。

表3 PCR引物序列

1.7 数据分析

试验数据采用SPASS 17.0 软件中单因素方差分析（one-way ANOVA）程序进行分析，采用Duncan’s法进行多重比较，P＜0.05 为差异显著，P＞0.05 为差异不显著。

2 结果与分析

2.1 植物精油和胰酶对肉鸡生长性能的影响（见表4～表6）

表4 植物精油和胰酶对肉鸡生长性能的影响(1～21 d)

表6 植物精油和胰酶对肉鸡生长性能的影响(1～42 d)

由表4 可知，试验前期（1～21 d），B 组和A 组相比，ADFI、ADG和21 d体重均下降，但差异不显著（P＞0.05），FCR 均为1.72。C 组和A 组相比，ADG、21 d体重和FCR 均有改善，但差异不显著（P＞0.05）。D～F 组与B 组、D～F 组与G 组相比，差异不显著（P＞0.05）。G 组与B 组相比，21 d 体重和FCR 有改善，但差异不显著（P＞0.05）。

由表5 可知，试验后期（22～42 d），B 组和A 组相比，ADG和42 d体重均下降，但差异不显著（P＞0.05）；FCR升高，但差异不显著（P＞0.05）。C组和A组相比，ADFI、ADG 和42 d 体重均有改善，但差异不显著（P＞0.05）；FCR 均为1.73。D～F 组与B 组相比，各项指标均有改善，且随着植物精油添加量的增加，FCR 有逐渐降低的趋势。G 组与B 组相比，各项指标均有改善。F组与G组差异不显著（P＞0.05）。

表5 植物精油和胰酶对肉鸡生长性能的影响(22～42 d)

由表6可知，整个试验期（1～42 d），B组和A组相比，ADFI、ADG和42 d体重均下降，但差异不显著（P＞0.05）；FCR 升高，但差异不显著（P＞0.05）。C 组和A组相比，各项指标均有改善，但差异不显著（P＞0.05）。D～F 组与B 组相比，ADFI、ADG、FCR 指标均有改善，且随着植物精油添加量的增加，FCR 有降低的趋势。G 组与B 组相比，各项指标均有改善。F 组与G 组相比，各项指标差异不显著（P＞0.05）。

2.2 植物精油和胰酶对肉鸡十二指肠消化酶活性影响（见表7）

表7 植物精油和胰酶对42 d肉鸡十二指肠消化酶活性影响(U/mg prot.)

由表7可知，42 d时B组Chy、LP、DIS活性低于A组，但差异不显著（P＞0.05），Tps高于A组差异不显著（P＞0.05）。C组Tps、Chy、LP活性高于A组，但差异不显著（P＞0.05）；C组DIS活性较A组显著提高了44.77%（P＜0.05）。随着植物精油添加量的增加，各项指标有逐渐提高的趋势，其中F 组酶活性最高。F 组中Chy、LP、DIS 活性显著高于B 组（P＜0.05），F 组中Tps 活性高于B 组，但差异不显著（P＞0.05）。E 组、F 组与G 组各项指标差异不显著（P＞0.05）。G组中各项酶活性显著高于B组（P＜0.05）。

2.3 植物精油和胰酶对肉鸡肠道炎症的影响（见表8）

表8 植物精油和胰酶对42 d肉鸡肠道炎症评分

由表8 可知，C 组和A 组相比、D～F 组与B 组相比，肠道炎症评分值降低，但差异不显著（P＞0.05）。且随着植物精油添加量的增加，肠道炎症有降低的趋势。D～F 组与G 组相比，评分值相当，差异不显著（P＞0.05）。

2.4 植物精油和胰酶对肉鸡肠黏膜组织炎性因子表达量的影响（见表9、表10）

表9 42 d肉鸡回肠黏膜组织炎性因子表达量

表10 42 d肉鸡空肠黏膜组织炎性因子表达量

由表9可知，整个试验期（第1～42 d），B组回肠黏膜组织炎性因子表达量高于A 组，但差异不显著（P＞0.05）。C组低于A组，但差异不显著（P＞0.05）。随着植物精油添加量的增加，炎性因子表达量有降低的趋势，其中F组最低。G组血清中IL-1β、IL-6表达量显著低于B组（P＜0.05），IL-4、IL-10表达量低于B组，但差异不显著（P＞0.05）。F组与G组各项指标差异不显著（P＞0.05）。

由表10 可知，整个试验期（第1～42 d），B 组空肠黏膜IL-1β、IL-4、IL-6、IL-10 高于A 组，但差异不显著（P＞0.05）；B组空肠黏膜IL-2、IL-8、TLR-4、TNF-α显著高于A 组（P＜0.05）。C 组空肠黏膜IL-1β、IL-4、IL-6、IL-10低于A组，但差异不显著（P＞0.05）；C组空肠黏膜IL-2、IL-8、TLR4、TNF-α显著低于A 组（P＜0.05）。随着植物精油添加量的增加，白细胞介素有逐渐降低的趋势，其中F 组白细胞介素最低。G 组空肠黏膜IL-1β、IL-6 低于B 组，但差异不显著（P＞0.05），G组空肠黏膜IL-2、IL-4、IL-8、IL-10、TLR-4和TNF-α显著低于B组（P＜0.05）。F组空肠黏膜IL-1β、IL-4、IL-6、IL-10与G组差异不显著（P＜0.05）。

3 讨论

3.1 植物精油和胰酶对肉鸡生长性能的影响

本试验研究结果表明，无论肉鸡是否感染产气荚膜梭菌，日粮中添加植物精油和胰酶均可以在一定程度上提高肉鸡生长性能。这说明植物精油和胰酶组合添加能让肉鸡更大程度利用饲粮中的营养成分，可以在一定程度上缓解蛋白饲料原料短缺现象。王兰等[7]研究表明，肉鸡日粮中添加植物精油对其生长性能无显著影响，但各试验组ADG、ADFI均不同程度提高、FCR降低，这说明植物精油对肉鸡有一定的促生长作用。日粮中添加酶制剂可以提高家禽生长性能[8-9]。在家禽饲粮中添加胰酶可以提高饲料转化率[10-11]。本试验结果与上述学者研究的结论相一致。Tiihonen等[12]研究表明日粮中添加植物精油可以有效改善肉鸡生长性能。显著性差异的原因可能与精油的添加剂量、组分、试验动物有关。在本试验中，在攻毒状态下，随着精油添加剂量的增大，肉鸡的日增重也逐渐提高，呈现剂量效应。

3.2 植物精油和胰酶对肉鸡十二指肠消化酶活性影响

本试验研究结果表明，日粮中添加植物精油和胰酶可以提高肉鸡十二指肠消化酶的活性。这是因为日粮中的豆粕含有大量的胰蛋白酶抑制因子，而胰蛋白酶抑制因子可显著降低小肠胰蛋白酶活性，添加胰酶和植物精油，可以提高十二指肠消化酶活性。

刘倩[10]研究结果表明，正常蛋白水平日粮，添加胰酶可以提高肉鸡十二指肠消化酶活性。王恩玲等[9]报道，饲粮中添加复合酶可以提高肉鸡消化酶活性。本试验研究的结论与上述学者研究的结论相一致。

3.3 植物精油和胰酶对肉鸡肠道炎症的影响

本试验研究结果表明，日粮中添加植物精油和胰酶可以在一定程度上缓解肉鸡肠道炎症。赵琛等[13]研究报道，日粮中添加植物精油可以减少单胃动物肠道炎症的发生。刘干[5]研究表明，复合酶制剂可以调控肉鸡肠道健康。这与本试验研究的结论相类似。

3.4 植物精油和胰酶对肉鸡肠黏膜组织炎性因子表达量的影响

本试验研究结果表明，日粮中添加植物精油和胰酶可以降低肠黏膜炎性因子表达量。刘娇等[14]研究结果表明，在攻毒作用下，日粮中添加植物精油可以降低肉鸭肠道黏膜炎性因子的表达量。刘娇[15]研究结果表明，日粮中添加酶制剂可以减少肉鸭炎症的发生。熊学林[16]研究表明，在妊娠后期、哺乳期母猪日粮中添加植物精油，可以降低其炎性反应。这与本试验研究的结论相类似。