亚麻油与棕榈油配比对绒山羊体外瘤胃微生物数量和脂肪代谢相关酶活性的影响

■姜联广 张 娟 郭晓宇 赵艳丽 郭咏梅 闫素梅

(内蒙古农业大学动物科学学院，动物 营养与饲料科学自治区高等学校重点实验室，内蒙 古呼和浩特 010018）

随着生活质量的提高，消费者对牛羊肉的营养价值关注越来越多，特别是对富含功能性营养成分的牛羊肉更是青睐有加。山羊肉相比于绵羊肉、牛肉所含的多不饱和脂肪酸(PUFA)更多[1]。近些年来，由于天然草场的资源限制，舍饲育肥成为了羊肉生产的主要方式。但舍饲时，绒山羊的n-3PUFA含量低于天然放牧，因此，研究者致力于通过营养途径调节舍饲羊肉的n-3PUFA组成。

反刍动物日粮中添加亚麻油或棕榈油都可以对肌肉组织的脂肪酸（FA）组成产生调节作用[2]。有研究发现在荷斯坦奶牛日粮中添加6.5%亚麻籽可显著增加牛奶脂肪中的n-3PUFA[3]，但其易抑制瘤胃发酵，且会加重氧化应激[4]，进而负面影响动物的生理功能。有人利用羊瘤胃液进行体外瘤胃发酵的研究得出棕榈油可以在不影响瘤胃发酵前提下提高PUFA含量[5]。但是，棕榈油不同添加剂量对体内FA组成的影响鲜有报道[6]。亚麻油与棕榈油进行混合添加相比于单独添加对反刍动物体内FA组成的优化结果不尽一致。有报道指出，奶牛日粮中添加单一亚麻油，其牛奶的PUFA 组成与品质优于棕榈油和亚麻油以1∶1 比例的混合添加组[7]。课题组前期的研究结果指出，亚麻油与棕榈油混合添加可以调节脂肪代谢相关酶的活性和瘤胃微生物的组成，其机制与棕榈油替代部分亚麻油后降低了瘤胃内亚麻油酸的氢化作用，增加了其过瘤胃效果有关[8]。提示亚麻油与棕榈油的混合添加改变了瘤胃中与脂类代谢有关的微生物和酶活性，但相关的研究报道甚少。鉴于此，本试验利用体外方法研究日粮中添加不同配比的亚麻油与棕榈油对绒山羊脂类代谢相关酶活性、微生物数量及营养物质降解的影响，研究结果对在舍饲条件下改善绒山羊体组织中n-3PUFA 的比例具有重要的理论和实际意义。

1 材料与方法

1.1 试验动物和试验设计

选择健康、体况相近、体重为（44.72±3.54）kg 的阿尔巴斯白绒山羊作为瘤胃液供体羊。供体羊每日8：00和15：00两次饲喂，自由饮水。采用单因素随机试验设计。共设7个处理组，一组为对照组(CON)，不添加任何油脂，一组为亚麻油组（LSO），只添加亚麻油，其余5组为混合油脂组，分别在底物日粮中添加按照设计要求确定的不同重量比例配合的亚麻油与棕榈油，亚麻油与棕榈油配比分别为9∶1（LP1）、8∶2（LP2）、7∶3（LP3）、6∶4（LP4）和5∶5（LP5）。除对照组外，各处理组油脂的添加总量均为2%。底物日粮精粗比为5∶5，其组成详见表1。体外培养体系60 mL（瘤胃液与缓冲液配比为1∶2），在体外培养24 h后采集样品。

表1 底物日粮组成及营养水平(风干基础)

1.2 测定指标与方法

1.2.1 脂肪代谢酶活性

先采集瘤胃液，配置缓冲液[9-10]。称取底物1 g，进行体外培养操作[9]，后终止发酵，过滤转移，-20 ℃保存待测酶活性相关指标，即用酶联免疫法[11]（ELISE）测定脂肪代谢相关酶活性，包括脂肪从头合成酶（FAS）、乙酰辅酶羧化酶（ACC）、超长链脂肪酸延长酶（ELOVL5）、苹果酸脱氢酶（MDH）、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶（G6PDH）；脂肪水解相关酶，如激素敏感脂酶（HSL）、脂蛋白脂酶（LPL）；脂肪酸去饱和相关酶，如硬脂酰辅酶A去饱和酶（SCD）、脂肪酸脱氢酶（FADS1）、丙酮酸脱氢酶激酶4（PDK4）。

1.2.2 瘤胃微生物数量

称取底物1 g，体外培养操作，后终止发酵，过滤转移，-80 ℃保存待进行瘤胃微生物DNA提取。本试验测定的体外培养液中的微生物主要包括：细菌总数（Total bacteria）、蛋白糖分解丁酸弧菌（B. proteoclasticum）、亨氏丁酸弧菌（B. hungatei）、白色瘤胃球菌（R.albus）和脂解厌氧弧杆菌（Anaerovibrio lipolytica）等。在瘤胃液微生物总DNA 提取后，采用实时荧光定量qPCR法[12]测定，其中引物设计如表2所示。

表2 PCR扩增引物

1.2.3 营养物质降解率

体外培养后，测定干物质（DM）、粗蛋白（CP）、粗脂肪（EE）、中性洗涤纤维（NDF）、酸性洗涤纤维（ADF）、Ca 及P 的降解率，其中DM、Ca、P 含量测定参考张丽英主编的《饲料分析及饲料质量检测技术》[15]。CP、EE含量分别使用半自动凯式定氮仪及海能脂肪测定仪进行测定[16]；NDF、ADF含量参考韩璐璐[17]试验操作方法测定。

养分降解率（%）=（放入尼龙袋中饲料某养分含量-消化后尼龙袋所剩某养分含量）/放入尼龙袋中饲料某养分含量×100

1.3 数据处理

采用SAS8.2 软件进行单因素方差分析，应用Duncan’s进行多重比较。

2 结果与分析

2.1 体外瘤胃培养液中的脂肪代谢相关酶活性（见表3）

表3 亚麻油与棕榈油不同配比对绒山羊体外瘤胃培养液中脂肪代谢相关酶活性的影响

如表3 所示，各处理组间FAS 活性和PDK4 活性均无显著差异（P=0.836、P=0.279）；LSO、LP4、LP5 组的ACC 活性显著高于CON 组及其他混合油组（P=0.001），LP2 组则较CON 组显著降低（P=0.001）；与CON 组相比，各添加油脂组G6PDH 活性均显著降低（P=0.002），且随亚麻油比例降低而降低，尤以LP4组最低；LSO、LP1 组MDH 活性显著高于CON 组（P=0.004），其他各组与CON 组差异并不显著；与CON 组相比，各添加油脂组HSL、ELOVL5、LPL 活性均显著升高（P=0.009、P=0.022、P=0.021），但各油脂组间无显著差异；除LP2 组外其他组FADS1 活性较CON 组显著升高（P=0.010）；LSO组的SCD活性显著高于CON组及除LP4 组以外其他各油脂组（P=0.002），LP1、LP2、LP3、LP4组随着棕榈油比例升高呈逐渐升高趋势。

2.2 体外模拟瘤胃培养液中微生物数量（见表4）

如表4所示，各组间Total bacteria数量无显著差异（P=0.409）。与CON组相比，各添加油脂组B.hungatei数量显著降低（P=0.006），LSO、LP1、LP2、LP3、LP4 组B.proteoclasticum数量较CON 组显著降低（P=0.042），其中LP4 组低，显著低于LSO 组和LP5组（P=0.042）。然而，各添加油脂组R. albus、Anaerovibrio lipolytica数量与CON 组相比均显著升高（P=0.041、P=0.004），但各添加油脂组间并无显著差异。

表4 亚麻油与棕榈油不同配比对绒山羊体外瘤胃培养液中微生物数量的影响（16S rDNA拷贝数以10为底的对数)

2.3 体外瘤胃培养液中的营养物质降解率（见表5）

表5 亚麻油与棕榈油不同配比对绒山羊体外营养物质降解率的影响（%）

由表5可知，各处理组DM、EE、CP、ADF、Ca、P的体外瘤胃降解率均差异不显著（P＞0.05）。相比于CON 组，LSO、LP1、LP2、LP3 组各添加油脂组NDF 降解率显著降低（P=0.040）。LP4 组在各油脂添加组中指标在数值上最高，但相比于LSO、LP1、LP2、LP3、LP5组并无显著差异（P＞0.05）。

3 讨论

前人研究表明，棕榈油部分替代亚麻油后可以通过提高脂肪代谢相关酶活性及瘤胃内微生物数量来改善体内FA的组成结构，但究竟替代多大比例更好，尚未见资料报道。HSL 和LPL 均为脂肪水解过程中的限速酶，SCD、ACC是脂肪酸合成过程中的关键酶，ELOVL5、FADS1 则对脂肪酸的去饱和与延长作用有重要作用[18]。在本试验中，LP4 组的上述酶活性均与亚麻油组相似，且两组均高于CON 组。课题组前期研究也得出了相似的结果。Wang 等[8]在绒山羊日粮中混合添加亚麻籽油与棕榈油（2∶1）时，发现其肌肉组织的FADS1 mRNA 表达会上调；在绒山羊日粮中添加热亚麻籽可提高ELOVL5活性[19]。Olaia等[20]发现肉羊日粮添加亚麻油可增加其皮下脂肪组织LPL 的mRNA 表达量；Choi 等[21]研究发现反刍动物日粮中添加亚麻籽油可刺激其皮下脂肪SCD基因的表达，与本研究结果相似。这表明亚麻油与棕榈油的混合添加比例为6∶4，即棕榈油部分替代亚麻油时对瘤胃内的脂肪降解、脂肪酸的合成、去饱和与延长作用可与单一添加亚麻油具有相同的促进效果，提示增加了亚麻油中C18∶3n-3 等n-3 PUFA 的过瘤胃效果，这也部分解释了课题组前期得出是棕榈油与亚麻油混合添加可以保护亚麻油中的C18∶3n-3免受瘤胃的降解[8]，增加过瘤胃效果。Adeyemi 等[22]发现亚麻油与富含C18∶1n-9c 的棕榈油混合添加可以降低C18∶3n-3在瘤胃内的氢化，使其转化为饱和脂肪酸（SFA）更少，本试验的酶活性变化可部分解释其原因。

G6PDH、MDH 与体内脂质合成过程的能量提供有关。本研究得出，LP4 组的G6PDH 活性显著低于CON 组；LSO 组的MDH 活性高于CON 组,且与LP4 组差异不显著，提示日粮中亚麻油与棕榈油以6∶4 混合添加可能导致瘤胃中FA从头合成减少。

Anaerovibrio lipolytica、R.albus、B.proteoclasticum、B.hungatei与脂肪酸在瘤胃中的氢化作用有关。姜雅慧等[23]发现B.proteoclasticum在反式C18∶1 转变为C18∶0 过程起主导作用。本试验中，各油脂添加组的体外瘤胃液Anaerovibrio lipolytica、R.albus的数量均显著高于CON组，B.proteoclasticum、B.hungatei的数量呈现相反之规律。这说明棕榈油代替亚麻油对瘤胃内脂肪酸的氢化作用效果与单一添加亚麻油相似。

在瘤胃营养物质降解率方面，各处理组的DM、EE、CP、ADF、Ca及P降解率均无显著差异，说明日粮中油脂的加入并未负面影响营养物质的降解；但油脂的添加不同程度降低了NDF降解率，与CON组相比，LSO、LP1、LP2 与LP3 混合油组显著降低，但LP4 与LP5组的降低不显著，说明LP4组、LP5组可减弱亚麻油添加对NDF降解引起的抑制作用。

综上所述，当亚麻油与棕榈油的混合配比为6∶4时，可以提高绒山羊体外瘤胃培养液中脂肪水解与脂肪酸从头合成相关酶活性，促进了脂肪酸的去饱和与延长作用；LP4 组可减少亚麻油中C18∶3n-3 等n-3 PUFA在瘤胃中的氢化，增加其过瘤胃效果，减弱亚麻油添加对NDF降解引起的抑制作用。然而，目前在该领域的研究甚少，确切的机理还有待于进一步探讨。

4 结论

亚麻油与棕榈油以6∶4 混合添加，可增加体外瘤胃培养液中脂类水解、脂肪酸的从头合成、去饱和与延长有关的酶活性，改变脂肪酸代谢相关微生物含量，减弱亚麻油添加对NDF降解引起的抑制作用。