复合有机酸对生长猪生长性能、养分消化率、抗氧化机能及粪便微生物组成的影响

■刘正群 李泽青 李 宁 于海霞 郑 梓 穆淑琴 王鸿英 闫 峻*

（1.天津市农业科学院畜牧兽医研究所，天津 300381；2.天津市农业发展服务中心，天津 300061）

生猪养殖过程中抗生素的滥用，极易导致细菌耐药性增加及环境污染等问题。因此，寻找安全、高效的饲料添加剂替代抗生素是当前养猪生产和研究中的热点问题[1]。有机酸作为一类天然、安全的饲料添加剂，在仔猪饲粮中添加可有效降低消化道pH，并提高消化酶的活性和养分消化率，从而提高动物生产性能[2]。同时，饲粮中有机酸的添加还可调控动物肠道微生物菌群组成，提高机体的抗氧化和免疫机能，起到保护胃肠道黏膜健康等作用[3-4]。有机酸是一类含有羧基的有机化合物，主要包括饱和脂肪酸和含有羟基或不饱和化学键的脂肪酸等，不同类型的有机酸的功能差异较大，但单一类型的有机酸的作用效果有限[5]。因此，为达到抑制有害菌、增强动物机体的抗氧化和免疫机能等效果，在动物饲粮中通常添加多种有机酸的复合物，而由于不同研究中有机酸的种类和组合并不一致，导致不同试验中复合有机酸的作用效果之间也存在较大差异[5-6]。前期关于有机酸的研究多集中在断奶仔猪阶段，而复合有机酸对20～50 kg的生长猪的生长性能、养分消化率及粪便微生物区系等的影响作用研究数据相对较少[2-6]。因此，本试验旨在研究特定比例的有机酸组合（甲酸、乳酸、柠檬酸和月桂酸）对生长猪生长性能、养分消化率、抗氧化功能和粪便微生物区系的影响，为复合有机酸在生长猪饲粮中的应用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

试验使用的复合有机酸制剂为甲酸、乳酸、柠檬酸和月桂酸的复合物，其中各种有机酸的比例分别为甲酸≥23.9%、乳酸≥14.5%、柠檬酸≥4.0%、月桂酸≥8.6%，其余为载体（二氧化硅）。

1.2 试验设计与饲养管理

试验选用初始体重相近（25.1±1.2）kg的“杜洛克×长白×大白”杂交阉公猪72头，随机分为2组，分别为对照组（CON组）和复合有机酸添加组（COA组），每组3个重复，每个重复12头。对照组饲喂基础饲粮，复合有机酸添加组则在基础饲粮中添加0.3%的复合有机酸。

基础饲粮中各营养成分含量满足或超过NRC（2012）[7]中生长猪的营养需要量，饲粮组成及营养水平见表1。预试期5 d，正式试验期28 d，期间猪只自由饮水和采食，并按照猪场正常的饲喂、免疫流程进行饲喂管理。

表1 基础饲粮组成及营养水平（风干基础）

1.3 测定指标

1.3.1 生长性能

正式试验第1 d 和试验结束后最后1 d 的早晨，对试验猪空腹称重，分别记为初重和末重，根据试验天数计算平均日采食量、平均日增重和料重比。

1.3.2 养分表观消化率

试验第12～14 d，以栏为单位收集粪便，在每天14：00-15：00 为收粪时间，连收3 d，用酸不溶灰分（AIA）作为内源指示剂测定粗蛋白（CP）、粗纤维（CF）、粗脂肪（EE）、钙（Ca）和磷（P）的表观全消化道消化率（ATTD）。

ATTD（%）=100-（AIAd×Nf）/（AIAf×Nd）×100

式中：AIAd——饲粮中酸不溶灰分的含量（%）；

Nf——粪样中养分的含量（%）；

AIAf——粪样中酸不溶灰分含量（%）；

Nd——饲粮中养分的含量（%）。

1.3.3 血清抗氧化指标

试验结束当天，每组每个重复随机选择1 头猪，空腹12 h后前腔静脉采血,低温条件下3 000 r/min离心15 min制备血清，于-20 ℃冰箱中保存待测。血清总超氧化物歧化酶（T-AOC）和谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）活性、丙二醛（MDA）含量测定使用ELISA方法，试剂盒购自南京建成生物工程研究所，具体操作步骤严格按照说明书进行。

1.3.4 粪便微生物多样性测定

在试验第27 d上午饲喂后，按照微生物试验采样要求，收集新鲜的仔猪粪便，每组每个重复收取6头猪的新鲜粪便。观察到猪只开始出现排便反应，及时戴好无菌手套接住粪便，尽量采集粪便中段3～5 cm的样品，约5 g转移至无菌冻存管中，立即放入液氮，之后转入-80 ℃超低温冰箱保存，用以进行粪便菌群分析。

使用DNA试剂盒（Omega, Bio-tek，Norcross，GA，USA）提取猪粪便样品的微生物总DNA，提取后使用2%的琼脂糖凝胶电泳及分光光度计（Thermo Fisher Scientific，Waltham，MA，USA）检测所提取的微生物DNA的总量和质量。对总量和质量达标的细菌16S rDNA基因的V3～V4高可变区设计含有barcode的特异引物，使用ABI GeneAmp®9700 型（Applied Biosystems，Foster City，CA，USA）PCR仪器，采用Trans Gen AP221-02体系进行PCR 扩增，特异性引物序列为：338F（5'-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3'）和806R（5'-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3'）。Illumina MiSeq（Illumina Inc., San Diego, CA，USA）测序和数据分析由百迈客生物科技有限公司测定（北京，中国）完成。微生物的DNA样品检测、PCR、纯化、建库、MiSeq测序及数据分析均按标准方法进行。使用Mothur（version v.1.30.1）及Usearch（vsesion 7.0）等软件，将测序序列在97%的相似水平下进行OUT（Operational Taxonomic Units）聚类及生物信息学统计分析。

1.4 统计分析

试验所得数据使用SAS 9.4软件GLM模块进行T检验，以P＜0.05作为差异显著性判断标准。

2 结果与分析

2.1 复合有机酸对生长猪生长性能的影响（见表2）

表2 复合有机酸对生长猪生长性能的影响

由表2可知，复合有机酸组生长猪的终末体重和总增重分别比对照组的生长猪增加2.71 kg和2.69 kg（P＜0.05），平均日采食量和平均日增重分别增加124.00 g 和96.19 g（P＜0.05），而料重比降低了0.13（P＜0.05）。

2.2 复合有机酸对生长猪养分表观全消化道消化率的影响（见表3）

表3 复合有机酸对生长猪养分表观全消化道消化率的影响(%)

由表3可知，与对照组相比，饲粮中添加复合有机酸的生长猪对饲粮中粗蛋白的表观全消化道消化率无显著影响，但粗脂肪、钙和磷的表观消化率分别显著提高了40.30%、28.24%和20.11%（P＜0.05），且复合有机酸的添加有提高粗纤维表观消化率的趋势（P=0.071）。

2.3 复合有机酸对生长猪血清抗氧化能力的影响（见表4）

表4 复合有机酸对生长猪血清抗氧化能力的影响

由表4 可知，与对照组相比，饲喂复合有机酸的生长猪的血清中总超氧化物歧化酶及谷胱甘肽过氧化物酶活性分别提高6.50 U/mL 和62.43 U/mL（P＜0.05），总抗氧化能力提高0.67 U/mL（P＜0.05），而丙二醛含量降低0.44 nmol/mL（P＜0.05）。

2.4 复合有机酸对生长猪粪样微生物组成及功能的影响（见图1～图5）

由图1 可知，与对照组相比，饲粮中添加复合有机酸对生长猪粪便微生物的多样性（Shannon指数，图1A）无显著差异，但Ace 指数（图1B）和Chao 指数（图1C）显著增加（P＜0.05），表明复合有机酸的添加提高了生长猪粪便微生物的相对丰度。

图1 粪便微生物α多样性

微生物的β-多样性采用主坐标分析（PCoA）和加权（weighted）的非度量多维尺度分析（Non-metric multidimensional scaling，NMDS），粪便样本微生物之间的距离在一定程度上代表了粪便微生物之间的差异度，距离越近越相似，距离越远差异越大。基于PCoA分析发现，复合有机酸组微生物与对照组微生物距离较远（图2A），而基于加权的NMDS分析属水平微生物的结果STRESS值均小于0.20，分析较可靠（图2B）。与对照组相比，复合有机酸组中微生物样品之间聚类明显，肠道微生物相似性较高的距离较近，说明在生长猪基础饲粮中添加复合有机酸可以有效改变其肠道微生物区系。

图2 粪便微生物β多样性

由图3可知，添加复合有机酸对生长猪粪便微生物在门水平上的组成影响较小（图3A），仅Kiritimatiellaeota 门微生物相对丰度提高了约1.2%（图3B）；而有机酸的添加对生长猪粪便微生物组成在属的水平上发生了明显改变（图3C），有机酸的添加显著提高了链球菌属（Streptococcus）的相对丰度，但显著降低了Prevotellaceae NK3B31 group和parabacteroides属 微 生物的相对丰度（图3D，P＜0.05）。

图3 生长猪粪便中门和属水平的微生物组成及差异

根据LEfSe进化树（LEfSe Cladogram）及LDA（Linear Discriminant Analysis）得分图显示（图4），复合有机酸的添加导致其粪便的核心微生物发生了变化。其中复合有机酸添加组中核心微生物为芽孢杆菌纲（Bacilli），乳杆菌目（Lactobacillales），链球菌科（Streptococcaceae）和乳杆菌科（Lactobacillaceae），链球菌属（Streptococcus）和乳杆菌属（Lactobacillus），及非解乳糖链球菌（Streptococcus alactolyticus），乳杆菌（Lactobacillussp.）和罗伊氏乳杆菌（Lactobacillus reuteri），其中芽孢杆菌纲LDA值最高为4.81。而对照组组的核心微生物为理研菌科（Rikenellaceae），Rikenellaceae RC9 gut group、Lachnospiraceae AC2044 group 和Prevotellaceae NK3B31 group 属，及uncultured bacterium g Rikenellaceae RC9 gut group、uncultured bacterium g Prevotellaceae NK3B31 group和uncultured bacterium g Lachnospiraceae AC2044 group等3种未培养的微生物，其中理研菌科LDA值最高为4.27。

图4 组间群落差异分析及LDA得分

使用PICRUSt2基于已经建立的胃肠道菌群结构数据库对两组粪便微生物区系进行KEGG功能预测，结果表明共注释到265个第三级分类水平的代谢通路，分别属于43个二级分类的KEGG代谢途径，其中丰度超过1%的微生物注释到的功能分别为：ABC转运、氨基糖和核苷酸糖代谢、氨酰-tRNA生物合成、氨基酸的生物合成、抗生素的生物合成、次生代谢物的生物合成、碳代谢、糖酵解/糖异生、代谢途径、不同环境中的微生物代谢、嘌呤代谢、嘧啶代谢、丙酮酸代谢、群体感应、核糖体、两组分系统及其他功能，且采食两种饲粮对两组粪便微生物主要代谢功能之间均无显著差异（图5）。

图5 生长猪粪便微生物KEGG功能预测

3 讨论

3.1 复合有机酸对生长猪生长性能及养分表观消化率的影响

幼龄动物（如断奶仔猪）由于其消化系统尚未完全发育成熟，胃中盐酸分泌不足，使得胃肠道pH升高，从而导致无法有效地消化饲粮中的蛋白质、淀粉等养分[8-9]。前期研究发现，断奶仔猪饲粮中有机酸制剂的添加可通过降低动物胃肠道pH，提高消化酶的活性，维持机体胃肠道最佳的消化环境，改善断奶仔猪的肠道健康，从而提高仔猪的生长性能，如提高仔猪的采食量、平均日增重及终体重，并降低料重比（F/G）和仔猪腹泻的发生[6，10-11]。但复合有机酸的添加对生长育肥猪生长性能影响的研究报道较少。Partanen等[12]研究表明，饲粮中添加复合有机酸（甲酸和乳酸）可提高育肥猪育肥期总增重及平均日增重，同时可提高饲料的转化率。同样地，栗敏等[13]和李马成等[14]研究发现，在生长育肥猪饲粮中添加不同剂量的代谢有机酸（丙酮酸、α-酮戊二酸和柠檬酸的混合物），均可一定程度提高生长育肥猪的生长性能。本研究结果与以上研究结果类似，在生长猪饲粮中添加复合有机酸可有效提高生长猪的生长性能（如提高平均日采食量、生长期总增重及平均日增重），同时可有效降低料重比。可能的机制是：部分有机酸具有芳香味，可以改善日粮的适口性，促进动物采食并增加采食量，同时降低消化道的pH、提高消化酶的活性进而促进生长猪的生长发育[2，4]；此外，部分有机酸可作为肠上皮细胞的一种代谢燃料，维护肠黏膜形态和功能的完整性，改善肠道消化吸收功能[15]。

前期研究发现，仔猪饲粮中添加有机酸可提高蛋白质等的表观消化率，同时还可减少有害气体的排放[16-18]。同样地，复合有机酸的添加可提高生长猪表观回肠氨基酸消化率及主要养分的表观全消化道消化率[19]。Boling 等[20]研究表明，柠檬酸的添加可提高生长猪对饲粮中植酸磷的利用。而在本研究中，猪饲粮添加复合有机酸后，显著提高了仔猪对粗脂肪、钙和磷等营养成分的表观全消化道消化率。其可能原因在于，饲粮中复合有机酸的添加可以降低动物胃肠道的pH，较低的pH 促进磷的溶解度，且可减缓胃排空速度，增加食糜在胃内的消化时间，更利于养分的消化和吸收[2，15，21]。因此，有机酸通常被作为一种可提高畜禽养分消化率的饲料添加剂。

3.2 复合有机酸对生长猪抗氧化功能的影响

机体氧化还原稳态的维持主要是依赖于机体氧化系统和抗氧化系统之间的动态平衡，自由基等产生过量或者机体抗氧化系统遭到破坏，则会打破这种动态平衡，引起氧化应激[22]。本研究与前期研究结果一致，生长猪饲粮中添加复合有机酸，可显著提高血清中总超氧化物歧化酶及谷胱甘肽过氧化物酶等的活性，提高了机体的总抗氧化能力，同时机体脂质过氧化的产物丙二醛含量也有所降低，表明有机酸可有效改善动物机体的抗氧化能力[23]。原因可能为部分有机酸可直接参与三羧酸循环供能，其额外产生的能量提高了机体对自由基清除能力，从而提高机体抗氧化能力；部分有机酸可通过谷胱甘肽过氧化物酶或其他非酶促反应，减少自由基的产生[5]，但其具体机制仍需进一步研究。

3.3 复合有机酸对生长猪粪便微生物组成及功能的影响

肠道微生物对机体的代谢和机体发育至关重要，保持动态平衡的肠道微生态环境不仅有助于仔猪对营养物质的消化、吸收，还能形成微生物屏障以阻止病原菌的入侵并促进其肠道发挥各种功能[24]。本研究发现，饲粮中添加有机酸显著提高了生长猪粪便微生物的Ace指数和Chao指数，同时复合有机酸添加组中微生物样品之间聚类明显，肠道微生物相似性较高，表明在生长猪饲粮中添加复合有机酸可以有效改变物种组成的丰富度和均匀度，改善其肠道微生物区系[5]。与前期研究结果一致，本研究发现添加复合有机酸后，可将生长猪粪便中核心微生物物种转换为非解乳糖链球菌（Streptococcus alactolyticus）、乳杆菌（Lactobacillussp.）和罗伊氏乳杆菌（Lactobacillus reuteri）等益生菌，同时可调节肠道免疫力与抗氧化能力，用于提高畜禽的肠道健康[25-27]。复合有机酸提高生长猪粪便中非解乳糖链球菌和罗伊氏乳杆菌等益生菌丰度可能途径为：有机酸的添加降低了消化道的pH，并使细菌所处的外部环境发生改变，导致其自身能量损耗，导致其生长受阻[28]；而消化道pH的降低也有利于刺激乳酸菌等有益菌的代谢活动，加速其生长和繁殖[27]。但复合有机酸促进益生菌增殖及促进肠道健康的具体机制仍需深入研究。

4 结论

综上所述，在本试验条件下，生长猪饲粮中添加0.3%复合有机酸可提高生长猪生长性能和抗氧化机能，同时可提高饲粮养分表观消化率和肠道有益菌的丰度，改善肠道菌群结构。