荷斯坦奶牛瘤胃部分微生物的分离鉴定及生物学特性分析

2022-04-13任雨龙王秋菊高炳南李畅洋

饲料工业 2022年7期

■任雨龙王秋菊孙愉张昊魏笑高炳南李畅洋

（黑龙江八一农垦大学动物科技学院，黑龙江大庆 163319）

近些年，为了减少抗生素在养殖行业中的大量滥用，人们开始研制各种微生物制剂来代替抗生素的使用[1]。微生物制剂在很多领域内都发挥着重要的作用，尤其是食品、饲料、农业等领域，有着较为广阔的发展前景[2-3]。瘤胃微生物与微生物制剂的研究也成为了人们较为感兴趣的内容，希望通过在饲料中添加某些微生物，直接或间接地改善反刍动物的生产性能，降低疾病发生概率，调节营养代谢的正常进行[4-5]。但目前用于反刍动物微生物制剂的菌种较为单一，而瘤胃又是反刍动物体内最复杂的消化系统之一，存在着大量的微生物。比如原虫、细菌、真菌等，也是营养物质消化分解的主要部位[6]。因此，如何从反刍动物瘤胃中发现更多能够用于研制微生物制剂的菌类，开发出效果更好的单菌或者复合微生物制剂，从而促进瘤胃生理功能的充分发挥，提高动物的营养利用效率，改善动物的生产性能，达到提高奶牛养殖行业生产收入的目的，是目前研究的主要内容。

本研究旨在通过16S rDNA序列同源性比较以及系统进化树分析等方法对分离的菌株进行种属鉴定，从荷斯坦奶牛瘤胃内分离出可以用于微生物制剂研制的菌类和引起常见疾病的病原菌，并确定其生化特性，从而为微生物制剂的研发提供备选菌种信息以及为有害病原菌的防治提供帮助。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 样品采集

从黑龙江省九三某奶牛养殖场选取10头荷斯坦奶牛，于早晨6：30～7：30利用负压装置采集瘤胃内容物，瘤胃内容物装瓶后，用封口膜缠绕瓶口，置于保温泡沫箱中迅速带回实验室，采样奶牛具体信息如表1所示。

表1 采样奶牛信息

本试验采样的养殖场根据产奶量以及泌乳天数进行分群饲养，采用全混合日粮（TMR）饲喂技术，青贮饲料、干草和精料等均衡供应，自由饮水。每天分别在06：00、14：00 和21：00 进行挤奶，发料车于每次挤奶30 min 后进行撒料。饲粮组成以及营养水平如表2所示。

表2 饲粮组成及营养水平（干物质基础）

1.1.2 引物合成与测序

在本试验中，提取完DNA进行PCR扩增时，添加细菌通用引物，由上海生物工程股份有限公司完成通用引物的合成以及测序内容。所用的引物序列为：

F：5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’。R：5’-GGTTACCTTGTTACGACTT-3’[7]。

1.1.3 培养基以及试剂（见表3）

表3 试验所用试剂

1.1.4 主要仪器（见表4）

表4 试验仪器设备

1.2 试验方法

1.2.1 培养基制备

将各培养基按照说明书配比称取好后置于250 mL无菌锥形瓶中，放于水浴锅中加热，玻璃棒搅拌溶解5～10 min。然后用牛皮纸将锥形瓶包好，再置于高压灭菌锅中，121 ℃，15 min，进行灭菌操作。灭菌完成后，待培养基温度冷却到手可以拿起时（50 ℃左右），进行倒板，培养基厚度大约为玻璃平皿高度的1/3。倒板结束后，待所有培养基冷却凝固，缠上封口膜，置于超净台中进行紫外线灭菌。

1.2.2 样品处理

事先将灭过菌的1 000 mL蓝盖瓶充满CO2置于水浴锅中37 ℃保温，准备一个泡沫箱，在泡沫箱中放一些保温袋，然后将蓝盖瓶放于泡沫箱中，等待采取瘤胃内容物。瘤胃内容物采集完成之后，使用无菌医用纱布过滤掉饲料残渣，滤液置于新的蓝盖瓶中，进行离心。

1.2.3 细菌培养

在超净台中，用生理盐水将离心好的瘤胃上清液稀释至不同的浓度（10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7、10-8、10-9），然后取10-6、10-7、10-8、10-9四个浓度进行涂布，每个浓度分别做两组，一组置于厌氧培养箱，另外一组置于常规恒温培养箱中培养，每组3个重复。接菌时每个培养平皿中接种100 μL 稀释菌液，用涂布棒将菌液均匀涂布在平皿中，做好标记。

在涂布完成后，每隔12 h将平皿里生长的单个菌落进行挑菌操作，将挑出的菌落用划线的方法接到新培养基平皿中，重复此步骤4～5次。若培养基平皿中的菌落完全相同，没有杂菌生长，则说明纯化培养完成，可进行后续试验。

1.2.4 菌的保存

纯化完成的菌一部分接种到液体培养基中，经37 ℃培养24 h 后，用移液枪抽取配置好的30%甘油以1∶1的比例，混合于EP管中，混匀后再置于-80 ℃冰箱中冻存，即完成保菌工作。

1.2.5 菌的鉴定

DNA 的提取通过物理提取法或者试剂盒提取均可达到试验要求，在本试验中，利用试剂盒（TIAN GEN）完成菌DNA 提取，再继续进行后续PCR扩增试验，扩增反应体系见表5。

表5 PCR反应体系

在进行PCR反应时，设置反应程序为：95 ℃、3 min，95 ℃、30 s，55 ℃、45 s，72 ℃延伸30 s，整个PCR反应包括30个循环，最后72 ℃延伸5 min。

在PCR 程序结束后，进行琼脂糖凝胶电泳试验，由于本试验中预计基因片段大小在1 500 bp左右，因此琼脂糖浓度选择1%即可满足试验需要。在凝胶样空中加入6 μL 扩增产物，同时使用DL 2000 Marker作为电泳参照。

电泳完成后，将符合预期大小的PCR产物送到委托公司测序。

1.2.6 生化特性鉴定

本试验所有细菌生化特性的鉴定方法主要参照《伯杰氏系统细菌学手册》和《微生物学及检验技术试验指导》进行。

①纤维素酶活性的鉴定[8]

培养基：羧甲基纤维素钠10 g、K2HPO40.5 g、MgSO4·7H2O、NaCl 0.5 g、（NH4）2SO41 g、琼脂15 g、纯化水1 000 mL。调pH至7.21，121 ℃灭菌20 min。

试剂：FeSO4·7H2O 0.1 g、MnCl20.1 g、ZnSO4·7H2O 0.1 g、100 mL纯化水。

评定方法：将接过菌的平板倒置于37 ℃恒温培养箱中，24 h 后，用移液枪吸取2 mL 的刚果红溶液（1 mg/mL）添加到培养基中，静置15 min 后倒去液体，添加2 mL的NaCl溶液（1 mol/mL），静置15 min后倒去液体，观察是否有透明圈产生，透明圈的大小跟菌降解纤维素的能力有关。

②产蛋白酶活性的鉴定[9]

培养基：Na2HPO4·7H2O 1.07 g、K2HPO40.36 g、酪蛋白4 g、ZnCl20.014 g、NaCl 1.2 g、CaCl20.002 g、MgSO4·7H2O 0.5 g、FeSO40.02 g、琼脂20 g、纯化水1 000 mL。

试剂：氯化汞15 g，浓盐酸20 mL，纯化水100 mL。

评定方法：将菌接种到培养基之后，37 ℃培养24-48 h，滴加显色试剂，观察菌落周围是否有透明区域产生。

③产淀粉酶活性的鉴定[9]

培养基：可溶性淀粉2 g、牛肉膏5 g、蛋白胨10 g、NaCl 5 g、琼脂20 g、纯化水1 000 mL。

试剂：碘液。

评定方法：将菌接种于平板上，37 ℃培养24 h，然后在菌落处滴加碘液，碘液范围要覆盖菌落，观察菌落周围有无透明圈出现，透明圈的大小与菌产生淀粉酶的能力有关。

④硝酸盐还原试验[10]

培养基：琥珀酸钠10 g、NaNO31 g、KH2PO41 g、MgSO4·7H2O 0.5 g、KCl 0.2 g、蒸馏水1 000 mL，配制完成后通CO22～3 min。

试剂：Griess试剂。

评定方法：将各个菌接入到培养基中，接完菌后37 ℃培养24 h。用移液枪或无菌注射器抽取菌液，取适量置于平皿中，平皿置于白纸上（使显色更加明显）。抽取配好的Griess 试剂，每个平皿中1 滴即可，30 s 后发生变色（即产生红色或者粉色，说明该菌具有还原性，若不变色，则不具有还原性）

⑤甲基红（Methyl red）试验[10]

培养基：蛋白胨0.5 g、葡萄糖0.5 g、KH2PO40.5 g、1 000 mL 纯化水、加热溶解，调pH 至7.2，6.895×10-2MPa，灭菌15 min，分装各个试管，具体配制视试验所需，按比例缩小。

试剂：甲基红0.02 g、95%乙醇溶液60 mL、纯化水40 mL，将甲基红碾碎放于乙醇溶液中，再添加纯化水。

评定方法：将菌接入试管中，35 ℃，48 h，取出部分培养液滴加甲基红指示剂，观察颜色变化。若为红色（即不变色），则呈阳性，若为黄色（即变色），则呈阴性。

⑥产硫化氢试验

培养基：醋酸铅培养基。

评定方法：本培养基可倒平板也可倒斜面（本研究发现倒斜面效果会更加明显），将菌穿刺接入培养基中，35 ℃培养24 h，观察结果，培养基变为黑色，呈阳性，无变化呈阴性。

⑦靛基质试验（吲哚试验）[11]

培养基：蛋白胨1 g、氯化钠0.5 g、1 000 mL 纯化水，调pH 至7.6，6.895×10-2MPa 灭菌15 min，分装各个试管。

试剂：对二甲基氨基苯甲醛5 g、95%乙醇溶液150 mL、浓盐酸50 mL。

评定方法：将菌分别接种到各个试管中，35 ℃培养24～48 h，取出部分培养液滴加显色试剂，观察颜色变化。若为红色（即变色），则呈阳性，若为黄色（即不变色），则呈阴性。

⑧尿素酶试验[11]

培养基：将葡萄糖1 g、蛋白胨1 g、KH2PO42 g、NaCl 5 g 混合于1 000 mL 纯化水中，加热溶解，调pH 至7.2，再加琼脂20 g、0.4 %酚红溶液2 mL，混匀过滤。高压灭菌20 min，待温度冷至60 ℃左右时，加入用滤菌器过滤的50 %尿素水1 mL，混匀后倒平板或者斜面。

评定方法：将菌接种入平板后，35 ℃培养18～24 h，观察结果。培养基呈红色为阳性，不变色为阴性。

⑨接触酶试验[12]

试剂：3%H2O2溶液。

评定方法：将菌液滴数滴置于高压灭菌的试管或者玻片上，再滴加3%的H2O2。若产生大量气泡则为阳性，没有气泡产生则为阴性。直接将3%H2O2溶液滴加到不含血液成分的菌培养液中，也能观察到上述现象。

2 结果与分析

2.1 琼脂糖凝胶电泳检测（见图1）

图1 部分细菌PCR扩增产物电泳结果

提取细菌DNA，进行PCR扩增，将PCR扩增产物进行电泳检测后，发现目的基因片段大小为1 500 bp左右，与预测基因片段大小相符。结果如图1所示。

2.2 基因测序（见表6、图2）

表6 16S rRNA系列比对结果

将PCR 扩增产物送至上海生物工程股份有限公司完成测序工作，再把测序结果在NCBI 的GenBank中进行同源性比对分析，发现获得菌种的同源性在99%以上，比对结果如表6所示。

本研究从奶牛瘤胃内容物中共分离得到32株细菌，12 种菌。主要包括：枯草芽孢杆菌CC2FG2、地衣芽孢杆菌LR2HG4、芽孢球菌PA3、马链球菌LU1542、不动杆菌Ue2-1、弗氏柠檬酸杆菌K32、假单胞菌705B5、溶血性葡萄球菌PH4-1、嗜麦芽寡养单胞菌LP1547、吉氏库特菌LA3、肠球菌DSM7374、双歧杆菌N145。

2.3 系统发育树（见图2）

图2 部分细菌系统发育树

利用Mega7.0 软件建立系统发育树，进一步证明了试验所筛选出来的菌与GenBank 比对结果的准确性，同源性均达到97%以上。

2.4 生化特性鉴定结果（见表7）

本研究主要对分离得到的菌进行了革兰氏阴阳性、硝酸还原、靛基质（吲哚）、产蛋白酶、淀粉酶、尿素酶、接触酶以及发酵葡萄糖、产硫化氢等特性进行了鉴定。生化特性鉴定的结果如下表7所示。

表7 不同菌种的生化特性鉴定

3 讨论

本研究中所用的培养基从功能上来划分，主要分为两种：富集培养基、分离培养基。但是有些分离培养基中得到的菌和目标菌并不相同，一部分原因可能是培养基的特异性不强，还有一部分原因可能是由于菌培养的环境不统一，比如湿度、氧气含量等，都可能会影响菌的生长以及传代过程[13]。此外，接菌、挑菌等操作的正确性也对试验有很大的影响，任何错误或者不当的操作都可能会造成菌的污染或者目标细菌的死亡[14]。

邓慧媛[15]从奶牛瘤胃中分离出了枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌等，本试验和其相比的话，培养出了弗氏柠檬酸杆菌、吉氏库特菌、嗜麦芽寡养单胞菌、双歧杆菌等菌种。这种情况主要是由于培养基成分以及培养环境的不同造成的。而近年来关于牛源嗜麦芽寡养单胞菌以及吉氏库特菌的研究较少，对其一些生物学特性并不清楚。本试验填充了这部分信息的空白。

此外，瘤胃微生物的分离可以根据试验所需制备不同成分的培养基，控制培养环境，从而筛选出想要获得的目标菌种。傅帅[16]通过减少培养基中蛋氨酸的含量，改进发酵条件，从瘤胃内容物中筛选出一株能够合成蛋氨酸的热带假丝酵母菌。王平[17]利用纤维素刚果红培养基和固体发酵培养复筛，从牛瘤胃内容物中分离出具有较强纤维素分解能力的纤维素酶高产菌株。在这些分离菌的试验中，影响分离菌株种类的一个重要因素是培养环境氧气含量。因为瘤胃中大多数的微生物都严格厌氧，如果在常规的恒温箱中培养，最后得到的是好氧菌或者兼性厌氧一类的菌种，而厌氧菌在这种环境中生长较为困难，这也是本试验中设计厌氧、好氧两种培养环境的原因。

有关分离动物微生物的研究较多，但研究对象大部分都集中在单胃动物上[18]，在反刍动物上主要关注于微生物多样性的分析，这可能与反刍动物独特的消化方式有关[19]。有研究认为由于瘤胃中存在大量微生物的原因，饲料中添加的单一菌种微生物制剂在较短时间会被反刍动物通过代谢作用排出体外[20]。在犊牛饲料中添加微生物制剂，会改变犊牛瘤胃微生物区系，影响优势菌的定植[21]。而在成年奶牛添加微生物制剂，在短时期内也会起到改善瘤胃内环境、增加奶牛的产奶量和增强免疫力等作用[22-25]。目前运用于反刍动物的微生物制剂较少，菌种较为单一，多种复合菌制剂的开发将是接下来研究的热点。因此，从瘤胃中分离更多微生物，可以为微生物制剂提供更多的菌种参考，帮助开发更多种类的反刍动物微生物制剂。