表面活性素体外抗菌效果研究

2022-04-13赵宾，白静

饲料博览 2022年1期

赵宾，白静

（1.北京英惠尔生物技术有限公司，北京 100081；2.北京师范大学静海附属学校，天津 301636）

表面活性素（Surfactin）是芽孢杆菌通过非核糖体合成途径合成的小分子脂蛋白。它由4 个亮氨酸、1个缬氨酸、1个谷氨酸和1个天冬氨酸共7个氨基酸残基的多肽环通过酯键与含有12~17个碳原子β-羟基脂肪酸结合形成内酯环状结构的两性化合物[1]。它是一种极具应用前景的微生物表面活性剂，只需较少剂量就可以使溶液体系界面状态发生明显变化[2]。正是由于其极强的表面活性能力赋予了它抗菌杀菌活性，其抗菌作用方式与抗生素不同，不具有特异性，不易引起病原菌的耐药性突变，随着细菌耐药性的问题越来越严重，人们渴望找到新型的抗菌杀菌产品，表面活性素就是抗生素的理想替代品之一[3]。随着养殖业“禁抗令”的颁布，表面活性素越来越被行业所关注。

许多研究表明，表面活性素具有抗细菌、真菌、肿瘤和病毒的作用，抗菌谱较广[4]，但是其对动物源致病菌的抑制效果报道少见。据此，笔者研究了表面活性素体外抗动物源性致病菌产气荚膜梭菌、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌与沙门氏菌的作用效果，并且与部分抗生素在抑制产气荚膜梭菌的能力方面进行了对比，旨在为表面活性素作为饲料添加剂在养殖行业中替代传统抗生素应用奠定理论基础。

1 材料

1.1 主要试剂及仪器

表面活性素（Surfactin），购自海麦克林生化科技有限公司；杆菌肽和亚甲基水杨酸杆菌肽，购自绿康生化股份有限公司；LB与RCM 培养基，购自青岛海博生物技术有限公司；紫外分光光度计（型号为UV5），购自梅特勒-托利多国际贸易（上海）有限公司；恒温培养箱（型号为HT-600B），购自冠森生物科技（上海）有限公司。

1.2 菌株

产气荚膜梭菌ATCC13124、产气荚膜梭菌CVCC52、产气荚膜梭菌CVCC2027、金黄色葡萄球菌ATCC6538P、大肠杆菌CVCC233、沙门氏菌SK236，均来自河南省工业微生物菌种工程技术研究中心。

2 方法

2.1 指示菌的活化及培养

从甘油管中吸取产气荚膜梭菌200 μL，分别转接至含有5 mL 的无菌RCM 液体培养基的试管中，各吸取1 mL 无菌液体石蜡加入接种完毕的试管中，置于培养箱中，37 ℃静置厌氧培养24 h。将培养后的产气荚膜梭菌菌液以2%的接种量接入新的装有50 mL 无菌RCM 液体培养基的250 mL 摇瓶中，各吸取5 mL 无菌液体石蜡加入接种完毕的试管中，置于培养箱，37 ℃静置厌氧培养24 h。调整菌浓度为5×108cfu·mL-1，获得试验用指示菌悬液，置4 ℃冰箱中贮存，备用。

分别从甘油管中吸取大肠杆菌CVCC233、金黄色葡萄球菌ATCC6538P 和沙门氏菌SK236 各200 μL，转接至含有5 mL无菌LB液体培养基的试管中，置于摇床培养中，37 ℃、180 r·min-1培养18 h。将培养后的菌液以2%的接种量接入新的装有50 mL 无菌LB 液体培养基的摇瓶中，置于恒温摇床中，37 ℃、180 r·min-1培养18 h。调整菌浓度为1.5×108cfu·mL-1，获得试验用指示菌悬液，置4 ℃冰箱中贮存，备用。

2.2 指示菌培养平板的制备

分别将指示菌悬液以2%的比例接种至无菌的固体培养基中（50 ℃），混匀后趁热倒入无菌培养皿中冷却，制得指示菌培养平板。

2.3 表面活性素对不同致病菌的抑菌效果

在无菌条件下将牛津杯置于制备好的指示菌平皿内，于牛津杯内加入10 μg·mL-1表面活性素100 μL（每样品做3 个平皿），将其放入4 ℃冰箱过夜[5]。待药液充分扩散后，置于37 ℃培养箱中培养24 h，其中产气荚膜梭菌指示菌平皿厌氧培养，其他致病菌有氧培养。取出后用游标卡尺测量抑菌圈直径，进行3次平行试验，最终求3次试验的平均值。

2.4 表面活性素与抗生素对产气荚膜梭菌的最低抑菌浓度（MIC）测定

取无菌试管11支，排成一排，第1支加入4.6 mL的RCM培养基，其余各管均加入1 mL的RCM，在第1 管中加入1 000 μg·mL-1测试样品0.4 mL，混匀，然后再吸取1 mL 于第2 管中，混匀再吸取1 mL 至第3 管中，如此倍比稀释至第9 管，从第9 管中吸取1 mL 弃去，第10 管为不含测试样品的对照管，第11管为只加RCM的阴性对照[6-7]。观察结果并记录，与对照组对比后确定MIC。

3 结果与分析

3.1 表面活性素对不同致病菌的抑菌效果

测定表面活性素对不同致病菌的抑菌圈直径，结果见表1。

表1 7种致病菌的抑菌圈直径平均值（R） mm

由表1可以看出，表面活性素对产气荚膜梭菌ATCC13124、产气荚膜梭菌CVCC52 和产气荚膜梭菌CVCC2027 病原性的产气荚膜梭菌的抑菌圈直径均超过了15 mm，说明表面活性素对产气荚膜梭菌为极敏感，对金黄色葡萄球菌的抑菌圈直径为8.78 mm，对大肠杆菌和沙门氏菌没有产生抑菌圈，说明表面活性素对大肠杆菌CVCC233和沙门氏菌SK236 的抑制作用不明显或者没有抑制作用。

3.2 最小抑菌浓度的测定

测定表面活性素、杆菌肽、亚甲基水杨酸杆菌肽对4种产气荚膜梭菌的MIC，结果见表2。

表2 表面活性素与2种抗生素对4种产气荚膜梭菌的MIC μg·mL-1

由表2可知，表面活性素、杆菌肽和亚甲基水杨酸杆菌肽对4 种产气荚膜梭菌均具有良好的抑菌效果，但MIC 尚有差别。表面活性素对产气荚膜梭菌ATCC13124的MIC为10 μg·mL-1，对产气荚膜梭菌CVCC52 和产气荚膜梭菌CVCC2027 的MIC为20 μg·mL-1，对产气荚膜梭菌CVCC2030 的MIC为40 μg·mL-1；杆菌肽对4 种产气荚膜梭菌的MIC均为16 μg·mL-1；亚甲基水杨酸杆菌肽对产气荚膜梭菌ATCC13124 的MIC 为0.5 μg·mL-1，对产气荚膜梭菌CVCC52 和产气荚膜梭菌CVCC2027 的MIC为1 μg·mL-1，对产气荚膜梭菌CVCC2030 的MIC为2 μg·mL-1。由以上结果可知，表面活性素对产气荚膜梭菌抑制效果与杆菌肽对产气荚膜梭菌的抑制效果大体一致。

4 讨论

本研究表明，表面活性素对产气荚膜梭菌和金黄色葡萄球菌等革兰氏阳性菌均产生了明显的抑菌圈，这与前人研究结果一致[8-9]。但表面活性素对大肠杆菌和沙门氏菌等革兰氏阴性菌没有产生抑菌圈，表明表面活性素对这两种阴性致病菌抑制作用不明显或者没有抑制作用。Zhou Z.Y.等[10]研究结果显示表面活性剂能抑制大肠杆菌，但对沙门氏菌没有有效的抑制作用。Huang X.Q.等[11]的研究结果显示表面活性素对沙门氏菌有较高的杀菌效果。这可能是因为表面活性素只对部分大肠杆菌和沙门氏菌有抑制作用，所以导致了本次试验结果与相关文献存在差异，此结果为后续探究表面活性素的抑菌谱提供了参考。

产气荚膜梭菌引起猪、牛、羊发病死亡率逐年升高，而且患畜死亡突然，易被怀疑为中毒死亡，在养殖业日益发达的今天，产气荚膜梭菌是所有梭菌属中引起肠道疾病最严重的病原[12-13]。杆菌肽作为多肽类抗菌药物，对多数革兰氏阳性菌有抑制作用，被广泛应用在饲料生产等领域[14-15]。本研究表明杆菌肽类抗生素对产气荚膜梭菌具有强烈的抑制作用，表面活性素对产气荚膜梭菌抑制效果与杆菌肽对产气荚膜梭菌抑制效果相近。表面活性素作为脂肽类生物表面活性剂具有广谱抗菌作用，表面活性素通过破坏细胞膜来发挥其抗菌作用[16]。表面活性素在合适浓度下，能够在细菌细胞膜上形成离子传导孔[17-18]，与Ca2+发生结合，促进细胞膜的渗透作用，破坏细胞膜发挥其抗菌作用。表面活性素还可以驱动其他单价和二价阳离子通过有机屏障，从而抑制环磷酸二酯酶的活性[19-20]，所以表面活性素对细菌的抑制作用没有特异性，不易引起病原菌的耐药性突变。由于表面活性素产量低，提纯成本高，用表面活性素直接饲喂动物的应用研究不多。多数研究还是利用芽孢杆菌液态发酵和固体发酵产生的多种脂肽代谢物去饲喂动物，并研究代谢物中表面活性素含量和饲喂效果的关系。比如，地衣芽孢杆菌固体发酵产物改善了受球虫攻毒后肉鸡的日增重，增加了抗球虫活力，调节了有益菌和有害菌的组成[21]。枯草芽孢杆菌发酵产物显著改善了梭菌攻毒状态下肉鸡的肠道形态和肠炎坏死情况，发酵物中的表面活性素是抑制产气荚膜梭菌的有效抗菌肽[22]。地衣芽孢杆菌固体发酵产物显著改善了梭菌攻毒状态下肉鸡的肠道形态和肠炎坏死情况，效果比商业抗生素还要好[21-23]。随着“禁抗令”的实施，表面活性素作为抗生素的替代品在畜禽生产和饲料加工中具有广泛的应用前景[16]。

表面活性素不仅具有广谱抗菌的优点，而且在免疫调节、抗氧化、促进动物生长、提高饲料利用率、提高胴体品质等方面有积极作用[16]。斜带石斑鱼饲料中添加100 mg 的表面活性素能够调节肝脏脂质代谢酶的活性，降低血清中总胆固醇、三酰甘油和低密度脂蛋白胆固醇的浓度，增加高密度脂蛋白胆固醇的浓度，改善脂质代谢，从而改善机体健康状况[24]。同时，表面活性素能够促进生长，提高饲料系数，提高斜带石斑鱼消化道蛋白酶和脂肪酶活性，降低血清中尿素氮、酸性磷酸酶和碱性磷酸酶活性，提高白蛋白和溶菌酶水平[25]。陈旭波[26]研究表明，断奶仔猪日粮中添加100~150 mg·kg-1的表面活性素可明显改善腹泻率，具有促生长作用，同时能降低血清中尿素的含量，具有一定降血脂作用。