罗非鱼湖病毒对稀有鲫(Gobiocypris rarus)的感染研究

吕月凤，王英英，曾伟伟，王 庆，李莹莹，尹纪元，杨 广，石存斌，王雅慧，李 波,4

（1.天津农学院水产学院，天津 300384；2.中国水产科学研究院珠江水产研究所/农业部水产药物开发重点实验室/广东省水产动物免疫技术重点实验室，广州 510385；3.佛山学院生命科学与工程学院/广东省动物分子设计与精密育种重点实验室，广东 佛山 440605；4.上海海洋大学水产与生命科学学院，上海 201306）

罗非鱼是世界上第2 大淡水养殖鱼类[1]，仅次于鲤科鱼类，每年全球产量约450万t，在超过100个国家养殖[2]。自2009 年开始，由罗非鱼湖病毒（TiLV）感染引起的新发烈性疫病罗非鱼湖病毒病（TiLVD）在全球多个国家相继暴发，对全球的罗非鱼养殖业构成了重大威胁[3-4]。截至目前，TiLV 的致病机理尚未明确，亦缺乏有效的防治措施。

目前的研究表明，TiLV 不仅感染罗非鱼及其变种，也可感染其他鱼类，如施氏魮、丝足鲈、孔雀鲈、河鲤[5]、爪哇鲤、鲶鱼等。目前TiLV 易感宿主都是大型鱼类，小型鱼类斑马鱼是最常用鱼类动物模型，有学者研究表明斑马鱼对TiLV 不敏感[6]。稀有鮈鲫属鲤科鮈鲫属，因其体形小、生命力强、饲养简单、不易染病，属于周年连续产卵鱼类，被认为是一种优良的实验鱼类。笔者前期试验表明，稀有鮈鲫对TiLV 敏感。本研究以稀有鮈鲫为研究对象，探索TiLV-2017A 株对稀有鮈鲫的感染特性，以期为为罗非鱼湖病毒病的病原学研究及防治技术开发奠定基础。

1 材料与方法

1.1 稀有鮈鲫和病毒

健康的稀有鮈鲫，中国科学院水生生物研究惠赠；罗非鱼湖病毒毒株（TiLV-2017A），德国动物健康研究所Sven Bergmann博士惠赠[7]。

1.2 鱼体攻毒和样品采集

感染组的稀有鮈鲫腹腔注射20 μL 浓度为105.67TCID50·mL-1的TiLV-2017A，对照组注射20 μL PBS液。分别在注射后第1、2、3、4和5天随机取9条稀有鮈鲫麻醉后处死，取鳃、脾脏、肾脏和肠道，检测白细胞介素-8（IL-8）、NK 细胞增强因子（NF-κB）、白细胞介素-1β（IL-1β）、Mx 蛋白（Mx）、Toll 样 受 体3（TLR3）、髓 样 分 化 因 子（MyD88）、α-干扰素（IFN-α）和Toll样受体5（TLR5）等免疫相关基因相对表达量。注射后第1、3、5、7、9、11、13 和15 天随机取3 条稀有鮈鲫麻醉后处死，分别取肝脾肾混样，用于测TiLV-2017A 在稀有鮈鲫体内不同时间的病毒载量变化。注射后第5 天，取3 条稀有鮈鲫（濒死鱼）进行组织切片，将试验鱼麻醉后处死，纵切剖开后整条用Bouin’s 固定剂固定，用于组织切片制备。

1.3 RNA提取及病毒载量分析

将组织样品匀浆，提取总RNA，反转录为cDNA。使用荧光定量试剂盒在ABI 7500 荧光定量仪上进行qRT-PCR，设置3次生物学重复。

1.4 免疫基因表达分析

研究中测定免疫相关基因的引物序列见表1。qRT-PCR 反应过程：95 ℃5 min，95 ℃5 s，60 ℃30 s，40个循环。

表1 免疫相关基因的引物序

SYBR Green 实时荧光定量PCR 的检测结果由ABI 7500 Real-Time PCR System 自带软件进行分析，相对表达量用ΔΔCT法进行计算。

1.5 组织切片观察

将Bouin’s 固定剂固定的稀有鮈鲫，在梯度浓度乙醇水溶液中脱水，然后与二甲苯混合，进行组织包埋、切片、染色。在光学显微镜下观察并拍照分析。

1.6 统计分析

所有的统计分析都是用SPSS 22.0 版软件进行的。试验鱼与对照鱼之间基因表达水平的差异用t检验进行分析，P<0.05 表示差异显著，P<0.01 表示差异极显著。图表用GraphPad Prism 6 软件生成，试验数据以“平均值±标准差（SD）”表示。

2 结果与分析

2.1 临床症状和死亡率

对照组稀有鮈鲫在试验期间无任何症状，健康无死亡鱼。感染组稀有鮈鲫在感染后第7天开始出现反应迟钝、腹下点状和片状出血、腹胀和眼球混浊等症状（见图1），与感染TiLV-2017A 的罗非鱼症状一致。感染组稀有鮈鲫的死亡率为10%。

图1 稀有鮈鲫感染TiLV-2017A后的临床症状

2.2 病毒载量检测

感染组稀有鮈鲫肝脾肾混样中病毒载量见图2。该病毒在第4天开始缓慢增殖，然后在第13天达到峰值，病毒拷贝数为1.582×108拷贝数·μL-1。

图2 稀有鮈鲫感染TiLV-2017A后肝脾肾混样组织中病毒载量

2.3 免疫相关表达基因检测

为了研究TiLV-2017A 株感染后稀有鮈鲫组织内免疫相关基因的变化，以稀有鮈鲫的脾脏、肾脏、肠和鳃组织为样本，测定其IFN-α、IL-1β、IL-8、Mx、MyD88、NF-κB、TLR3和TLR5基因的相对表达量，结果见图3。

图3 稀有鮈鲫TiLV-2017A株感染后脾脏、肾脏、鳃、肠道组织中免疫相关基因的相对表达量

由图3可知，脾脏、鳃、肾脏和肠组织中IL-8基因的表达水平均上调，在肠组织中上调显著，相对表达水平达到74.790倍。鳃、肠和肾脏中NF-κB基因的表达水平上调。IL-1β的基因表达在脾脏、鳃、肾脏和肠组织中均上调。肠组织中Mx 的表达水平显着增加，在第4天增加了165.897倍。脾脏、鳃和肠中TLR3的mRNA 表达上调，在鳃中显著上调54.538 倍，在肠组织中显著上调61.133 倍。MyD88的表达水平在肠中显著上调。肾和鳃中IFNα的mRNA水平显著降低，并且在肠中显著上调。肠中TLR5基因的表达在第2天显著增加140.611倍。

2.4 组织病理切片观察

为观察TiLV-2017A 感染稀有鮈鲫后的组织病理变化，取感染后第5 天稀有鮈鲫的肝脏、脾脏、肾脏、头肾和鳃组织，经过固定、脱水、包埋、切片和苏木素-伊红染色后置于光学显微镜下观察，结果发现稀有鮈鲫肝脏、脾脏、肾脏、鳃和头肾均出现明显的病理变化，见图4。

图4 稀有鮈鲫感染TiLV-2017A后第5天组织病理学研究

由图4 可知，肝脏中肝细胞肿大和空泡化，细胞间隙增大，肝窦萎缩；脾脏中淋巴细胞增多，噬铁血黄素明显增多；肾小管细胞间隙变大且肾组织中噬铁血黄素增多；感染鱼头肾可见大量嗜碱性的肿大细胞，且组织结构松散，大量细胞发生核固缩，红细胞浸润；鳃组织中鳃丝部分断裂，鳃丝溃烂不成形和上皮细胞脱落。

3 讨论与结论

稀有鮈鲫是一种小型的实验动物，具有生长速度快、易繁殖、遗传背景清晰的特点，可感染草鱼呼肠孤病毒等水生动物病毒。笔者前期研究发现稀有鮈鲫可感染TiLV。本研究的目的是通过测定稀有鮈鲫感染TiLV 后的临床症状、病毒载量和免疫相关因子相对表达量的变化情况，进而研究稀有鮈鲫感染TiLV的致病机制。

稀有鮈鲫感染TiLV-2017A 第7 天，鱼体开始出现明显的临床症状，腹侧及腹下皮肤点状和片状出血，内脏出血，腹部鼓胀有腹水，眼部出现眼睛突出、晶状体浑浊，游动不规则伴有神经症状。测定稀有鮈鲫感染TiLV-2017A 毒株后肝脏、脾脏和肾脏混样组织第1、3、5、7、9、11、13和15天时的病毒载量，结果表明稀有鮈鲫在感染TiLV-2017A 后的第13 天病毒载量达到峰值，为1.582×108拷贝数·μL-1。该结果与胡虎子[8]在罗非鱼感染TiLV的研究结果基本一致。

K.K.Mugimba 等[9]研究了两种促炎细胞因IL-1β和TNF-α在TiLV 感染的红罗非鱼和灰罗非鱼脑、头肾和肝脏中的表达，均在各组织中有不同程度的上调。在斑马鱼腹腔注射TiLV试验中启动IL-1β、TNF-α、TLR3、IL-8、TFNγ1-2 和Mx 等相关免疫基因的表达[6]。在本研究中以稀有鮈鲫的肝脏、脾脏、肠和鳃组织为样本，测定其感染TiLV-2017A 后 体 内IL-8、NF-kB、IL-1β、TNF-α、Mx、TLR3、MyD88、IFNα 和TLR5 基因的相对表达量。脾脏、鳃、肾脏和肠组织中各基因的表达水平均有不同幅度的上调。因此说稀有鮈鲫可以作为研究TiLV 与宿主相互作用的病毒免疫逃逸模式鱼。病理切片结果与李嘉波等[10]的这5 个组织H.E染色结果一致。肝细胞肿大和空泡化，肝窦萎缩；脾脏中淋巴细胞增多，噬铁血黄素明显增多；肾组织中噬铁血黄素增多；鳃组织中鳃丝部分断裂，鳃丝溃烂不成形和上皮细胞脱落；头肾可见大量嗜碱性的肿大细胞，且组织结构松散，大量细胞发生核固缩，红细胞浸润。

笔者前期研究[11]表明，感染了TiLV-2017A 的罗非鱼的死亡率高达100%。然而，在本研究中，TiLV-2017A 感染稀有鮈鲫死亡率为10%左右，而大多数鱼能抵抗病毒而存活，稀有鮈鲫在感染TiLV后如何发挥其抗病毒作用需要进一步研究。