固相萃取-超高效液相色谱-串联质谱法测定兽药制剂中巴比妥类药物

张海超， 高美华， 刘蓓蕾， 王 敬， 艾连峰*， 霍惠玲， 李研东

(1.石家庄海关技术中心，河北石家庄 050051；2.河北省兽药监察所，河北石家庄 050035)

巴比妥类药物是一类作用于中枢神经系统的安眠镇静剂[1]，常见的有巴比妥、苯巴比妥、异戊巴比妥和司可巴比妥。该类药物在畜牧养殖中具有减少动物应激反应、降低运动消耗和增重催肥的作用[2]，但具有很强的毒副作用，易产生依赖性，可引起蓄积性中毒。人长期服用含有巴比妥类药物的动物源性食品会使肝脏负担加重，头脑昏沉，引起记忆受损，同时还会使运动神经和肌肉功能受到抑制。我国农业部早于2002年就发布176号公告，严禁巴比妥、异戊巴比妥和苯巴比妥用于畜禽养殖业，但受利益驱使将这些药物非法添加到兽药制剂中的事件时有发生，养殖户在不知情的情况下使用，不仅诱导畜禽产生耐药性，而且导致药物在动物源性食品中残留，给人们带来潜在的健康风险。目前针对兽药制剂中非法添加的巴比妥类药物的研究未见报道。因此，为规范兽药市场秩序，保证用药质量安全，建立兽药制剂中巴比妥类药物的检测技术具有十分重要的现实意义。

当前关于巴比妥类药物的检测基质主要是动物源性食品[3 - 6]、饲料[2,7,8]、保健食品[9]及生物样本[10 - 14]。随着质谱技术的普遍使用，气相色谱-质谱法[3 - 6,10,12]和液相色谱-串联质谱法[2,5,7-9,11,13,14]已成为该类药物的主要检测手段。气相色谱-质谱法往往需要衍生化，其操作较为繁琐。液相色谱-串联质谱法，灵敏度高、实用性强，适用于兽药基质中巴比妥类药物的测定。本研究采用乙腈提取兽药制剂中巴比妥、苯巴比妥、司可巴比妥和异戊巴比妥4种药物成分，经HLB固相萃取柱净化后，使用超高效液相色谱-串联质谱法(UPLC-MS/MS)，测定了兽药制剂中非法添加的4种巴比妥类药物。该方法净化效果好，普适性强，为兽药制剂中巴比妥类药物的测定提供了新途径。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

8050超高效液相色谱-串联质谱仪(日本，Shimadzu公司)；3K-15离心机(美国，Sigma公司)；PT2100型均质器(瑞士，Kinematica公司)；TurboVap LV氮吹仪(美国，Biotage公司)；Milli-Q纯水机(美国，Millipore公司)；HLB固相萃取柱(200 mg/6mL，美国Waters公司)。

巴比妥(CAS号：57-44-3)、苯巴比妥(CAS号：50-06-6)、异戊巴比妥(CAS号：57-43-2)和司可巴比妥CAS号：76-73-3)标准品购于德国Dr.Ehrenstorfer公司，纯度大于97%。乙腈、正己烷、乙酸乙酯、甲醇(色谱纯，德国Merck公司)；甲酸、乙酸、NH4Ac(优级纯，德国Fluka公司)；NaCl(分析纯，国药集团化学试剂有限公司)。

1.2 混合标准溶液配制

分别称取巴比妥、苯巴比妥、异戊巴比妥和司可巴比妥标准品各10 mg(精确至0.01 mg)，用甲醇溶解并定容至10 mL，配成质量浓度均为1 mg/mL的标准储备溶液，于4 ℃下避光保存，有效期为6个月。根据需要，准确移取适量巴比妥标准储备溶液，用甲醇-水(1∶1，V/V)稀释成混合标准工作溶液，待用。

1.3 样品预处理

粉剂样品：准确称取2 g样品(精确到0.01 g)于50 mL塑料离心管中，加入20 mL乙腈，于均质器上12 000 r/min均质1 min。针剂和合剂样品：准确称取2 g样品(精确到0.01 g)于50 mL塑料离心管中，加入20 mL乙腈和4 g NaCl，于均质器上12 000 r/min均质1 min。将各样品提取液以8 000 r/min离心5 min，取5 mL上清液于另一50 mL离心管中，加入10 mL乙腈饱和的正己烷，涡旋混合，离心，取下层乙腈在45 ℃下氮气吹至近干。用5 mL 0.1 mol/L NH4Ac缓冲溶液(pH=5.0)-甲醇(9∶1，V/V)充分溶解残渣，待净化。

将HLB固相萃取柱置于固相萃取装置中，先后用5 mL甲醇和5 mL 0.1 mol/L NH4Ac缓冲溶液(pH=5.0)预淋洗，将上述提取液过柱，控制流速为0.5 mL/min。用5 mL 0.1 mol/L NH4Ac缓冲溶液(pH=5.0)-甲醇(9∶1，V/V)淋洗，抽干。随后用5 mL正己烷和5 mL正己烷-乙酸乙酯(95∶5，V/V)淋洗，最后用8 mL正己烷-乙酸乙酯(1∶1，V/V)洗脱。将洗脱液在45 ℃下用氮气吹干，用1 mL甲醇-水(1∶1，V/V)溶解残渣，过0.22 μm有机滤膜后，供UPLC-MS/MS测试。

1.4 仪器分析条件

色谱条件：Waters ACQUITY UPLC BEH C18色谱柱(100 mm×2.1 mm,1.7 μm)；流动相：水(A)和乙腈(B)。梯度洗脱程序：0～1 min，10%B；1～5 min，10%～90%B；5～6 min，90%B；6～6.01 min，90%～10%B；6.01～8 min，10%B。流速：0.4 mL/min；柱温：35 ℃；进样量：5 μL。

质谱条件：电喷雾电离源，负离子(ESI-)模式扫描；采用多反应监测(MRM)模式检测。离子源温度：400 ℃；毛细管温度：250 ℃；加热模块温度：350 ℃；氮气流速：3.0 L/min；干燥气流速：10.0 L/min；加热气流速：10.0 L/min。其他参数见表1。

表1 4种巴比妥药物的质谱分析参数

2 结果与讨论

2.1 兽药制剂抽样种类的选择

安痛定注射液具有镇静、催眠和抗惊厥作用，可用于动物的解热镇痛和抗风湿，治疗肌肉痛、关节痛和神经痛等；白头翁散具有镇痛、抗痉挛等功效，可用于治疗湿热泄泻、下痢脓血等；杨树花口服液具有清热解毒、化湿止痢、健脾养胃的功效，还可缓解畜禽在疾病期间的应激反应。巴比妥类药物镇静效果好、价格低廉，在畜禽养殖中极有可能被非法添加到具有类似功能主治的兽药制剂中。故选择以上3种类型兽药制剂(针剂、粉剂、合剂)作为代表，建立兽药制剂中巴比妥类药物的测定方法。

2.2 前处理方式的优化

巴比妥类药物为取代的丙二酰脲类化合物。分子中的内酰亚胺结构能够互变为烯醇式而呈弱酸性，pKa为7.4，文献报道该类药物常用的提取溶剂有乙腈、酸性乙腈和三氯甲烷。本实验对比了这3种溶剂的提取效果。实验表明，3种提取溶剂对巴比妥类药物的提取率无明显差异，但三氯甲烷提取溶液颜色较深，因此从实验简便性和提取更少杂质考虑，本方法采用乙腈提取，氮吹干后，以磷酸盐缓冲溶液(pH=5)-甲醇混合溶液溶解上样。兽药制剂基质含有大量油脂，在磷酸盐缓冲液中加入适量甲醇溶解可保证化合物溶解充分。上样液选用pH值为5的磷酸盐缓冲溶液可保证目标物呈中性状态。

本文首先参考国家标准(GB/T 23741-2009)中的净化方式，采用HLB固相萃取柱进行净化，用磷酸缓冲溶液和甲醇水溶液淋洗，二氯甲烷洗脱，发现基质干扰严重，影响了化合物的的响应值，巴比妥、异戊巴比妥、苯巴比妥和司可巴比妥采用此种净化方式后的MRM色谱图见图1a。为消除基质干扰获得较高回收率，本实验对净化过程进行了优化，首先对提取液用正己烷进行了液液萃取，然后在固相萃取过程中利用极性相互作用，用正己烷进行淋洗，去除了大量非极性杂质干扰。最后用正己烷-乙酸乙酯混合溶剂洗脱，避免了同时洗脱出大量极性杂质，巴比妥、异戊巴比妥、苯巴比妥和司可巴比妥经优化净化流程后的MRM色谱图见图1b。由此图可见，经优化后本实验的净化效果显著。

图1 4种巴比妥类药物在两种净化方式下MRM色谱图(a:优化前；b;优化后)

2.3 质谱条件的优化

方法采用MRM模式对待测物的质谱条件进行优化。将4种巴比妥类药物分别在正、负离子扫描模式下进行扫描，结果显示4种化合物均在负离子模式下质谱信号较强，因此选择准分子离子峰[M-H]-作为母离子。然后在负离子模式下对[M-H]-峰进行子离子扫描，选择响应值最大的碎片离子为定量离子，次级响应最大的碎片离子为定性离子，然后自动优化碰撞能量、Q1和Q3电压等质谱参数。优化的质谱参数如表1所示。

2.4 色谱条件的优化

流动相的组成和添加剂对分析物的峰形、基质效应和离子化效率均会造成一定的影响。本文在文献研究的基础上，考察了不同流动相组成对于分析物灵敏度的影响。首先选取了乙腈-0.1%甲酸水溶液、乙腈-水溶液和甲醇-水溶液三组流动相组成，考察了对50 ng/mL的标准溶液灵敏度的影响，结果见图2a。由此图可以看出，在流动相中加入一定比例的甲酸会对化合物灵敏度产生抑制作用，甲醇和乙腈对4种化合物灵敏度影响差异不大。随后本实验把三组流动相组成对50 ng/mL的基质标准溶液灵敏度的影响做了比较。由图2b可见，在基质的影响下各化合物的灵敏度均受到抑制，但甲醇比乙腈对4种化合物的抑制效应更强。因此，最终选择乙腈-水溶液作为本实验流动相，4种化合物灵敏度最高。

图2 流动相对4种巴比妥类药物标准溶液(a)和基质标准溶液(b)灵敏度的影响

2.5 基质效应、线性范围、检出限和定量限

本研究通过优化净化方式和流动相组成消弱了部分基质效应的干扰，但兽药制剂基质较为复杂，目标物在基质中依然存在一定的的基质抑制现象。取空白基质溶液和溶剂分别配制50 μg/L的混合标准溶液，按照本方法进行测定，基质效应在31%～82%之间。为保证定量结果的准确性，本实验采用空白样品配制标准溶液进行校正，从而降低基质效应的影响。

取适量的标准储备溶液，用空白基质溶液配制20、50、100、200、500、1 000 μg/L的系列混合标准工作溶液，在优化条件下测定，以质量浓度为横坐标(X，μg/L)，分析物峰面积为纵坐标(Y)，绘制标准曲线，回归方程、相关系数见表2。4种巴比妥类药物在20～1 000 μg/L范围内线性关系良好，相关系数(r)均大于0.9980。在空白样品中添加混合标准品溶液，以信噪比(S/N)≥3时的含量为方法的检出限(LOD)，以S/N≥10时的含量为方法的定量限(LOQ)，LOD和LOQ分别为20 μg/kg、50 μg/kg。

表2 不同基质中4种巴比妥类药物的线性方程和相关系数r

(续表2)

2.6 方法的回收率和精密度

选取了安痛定注射液、白头翁散、杨树花口服液空白样品，分别添加50、100和500 μg/kg 3个质量浓度，按本方法进行处理和测定，进行加入回收实验，每个水平测定6次，其回收率及相对标准偏差(RSD)见表3。由表3可知，方法的回收率在70.5%～96.4%之间，RSD在3.3%～10.4%之间。

表3 方法的加标回收率及相对标准偏差(RSD)(n=6)

2.7 实际样品分析

采用本方法对送检的15份兽药制剂样品进行了测定，均未发现阳性样品。

3 结论

本研究应用HLB固相萃取柱净化，以超高效液相色谱-串联质谱联用技术，开发了兽药制剂中4种巴比妥类药物的检测方法。本方法采用乙腈提取，HLB固相萃取柱进行净化，通过对固相萃取过程优化，降低了基质效应对定量结果的影响，方法操作简单、普适性强。该方法的建立为分析兽药制剂中巴比妥类药物提供了新的技术手段。