基于酶-高分子共聚物的纸芯片用于葡萄糖的快速比色法检测

童志平， 易舒婷， 刘甜甜， 郭 婷， 孟 涛*

(西南交通大学生命科学与工程学院，四川成都 610031)

糖尿病是一种以高血糖为主要特征的终身性代谢疾病。在21世纪，随着人们生活水平的提高和饮食习惯的改变，糖尿病已经成为了一种全球性的“流行病”[1 - 3]。长期过量的摄入葡萄糖将会诱发糖尿病和一系列并发症[4,5]。因此，葡萄糖作为当今威胁人类健康的“隐形杀手”，在临床医学、食品分析和环境监测等领域都需要简单、方便和快速的检测方法[6,7]。最常见的葡萄糖即时检测方法是已商业化的、基于电化学原理的血糖仪和基于比色原理的血糖试纸。其中，比色试纸因其不依赖仪器、操作简单、不受环境限制、结果可视化等优势成为了一种用户友好的检测方式[8,9]。然而，目前市售的血糖比色试纸用于检测葡萄糖时存在着一些缺陷：(1)天然酶固有的不稳定性使得这些试纸在高温环境下和长期储存时，由于酶活性的下降导致试纸的使用寿命变短，检测结果不准确[10 - 12]；(2)过量的酶被固载在试纸上以提高催化速率，加快检测速度，从而导致分析的成本较高；(3)由于灵敏度较低，血糖比色试纸难以满足低浓度葡萄糖的检测。因此，解决葡萄糖比色试纸存在的这些缺点迫在眉睫。

聚乙二醇化(PEG化)是一种生物相容性高的蛋白质交联固定化技术。这种技术可以通过将PEG高分子链末端的羟基改性为活泼基团后，与蛋白质表面的氨基或羧基发生共价结合，形成酶-高分子共聚物。PEG化能够稳定酶蛋白的构象，提高酶的稳定性，并且对酶的活性影响较小[13 - 16]。基于此，本研究利用已经PEG化的葡萄糖氧化酶(GOX)和辣根过氧化物酶(HRP)，制备了酶-高分子共聚物纳米颗粒(mPEG -GOX& HRP conjugate nanoparticles,mCNPs)，并将其固载在纸芯片上用于葡萄糖的比色法检测。图1为mCNPs纸芯片检测葡萄糖的原理示意图。与已经报道的一些基于载体的固定化酶的方式比较[17 - 19]，这种高分子链交联固定酶的方式减弱了载体带来的传质阻力，加快了酶反应速率，可以快速完成葡萄糖的比色检测。本方法构建的mCNPs纸芯片具有操作简单、检测快速、灵敏度高、稳定性高等优点，并且检测结果具有良好的重现性，为葡萄糖的现场即时检测提供了新的平台。

图1 mCNPs纸芯片检测原理示意图。(a)裁剪纸芯片；(b)mCNPs纸芯片的制备和显色机理。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

JSM-7001F型场发射扫描电子显微镜(SEM)，JSM-7001F型X射线能谱仪(EDS)(日本，电子株式会社)；pHB-3C型pH计(上海仪电科学仪器股份有限公司)；FHG -9070A型电热恒温鼓风干燥箱(上海培因实验仪器有限公司)；VORTEX-5型涡旋混合器(海门市其林贝尔仪器制造有限公司)；FA2204N型电子天平(上海菁海仪器有限公司)。

单甲氧基聚乙二醇醛(mPEG -ALD，5 kDa)购于湖南华腾制药有限公司；GOX(160 kDa，来源于黑曲霉)、HRP(44 kDa，来源于辣根)、牛血清白蛋白、Whatman©1#号滤纸和2，2-联氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二铵盐(ABTS显色剂)，均购于Sigma-Aldrich公司；HCl、Na2HPO4、NaH2PO4、酚酞和琼脂糖均购于国药集团化学试剂有限公司；NaCl和KCl购于成都科龙化学试剂有限公司；无水葡萄糖和L-抗坏血酸购于上海麦克林生化科技有限公司。实验水为去离子水。

人血清样本由成都某人民医院提供。

1.2 mCNPs溶液的制备

mCNPs的合成参考文献方法[20]。首先，使用0.1 mol/L的HCl将其配成pH=5的水溶液(笔式pH计校准)。然后，吸取1 mL的pH=5的水溶液，加入4 mg的GOX冻干粉和0.4 mg的HRP冻干粉，使用涡旋振荡器(100 r/min)搅拌溶液1 min后，再加入4 mg的mPEG -ALD，搅拌溶液使其充分溶解混合。最后，将反应溶液密封并置于室温下静置反应24 h后，即得mCNPs溶液(本文中所用的mCNPs溶液均用此方法制备)。

1.3 mCNPs纸芯片的制备

1.3.1 纸芯片的制作为保证纸芯片尺寸均一且制作方便，使用市售的打孔机将纤维素纸裁剪成直径为5.5 mm的圆形纸片，一次裁剪可得6张大小尺寸均一的纸芯片。

1.3.2 mCNPs纸芯片的制作首先，称取5.5 mg的ABTS溶于1 mL水中制10 mmol/L的显色剂溶液。然后，用移液枪吸取3 μL的显色剂溶液滴加到纸芯片上，室温下待其完全干燥。最后，用移液枪吸取3 μL的mCNPs溶液滴加到载有显色剂的纸芯片上，然后将纸芯片置于温度37 ℃的恒温鼓风干燥箱中干燥5～10 min。即得mCNPs纸芯片。

1.4 葡萄糖的检测

在本文所采用的级联酶反应中，葡萄糖在GOX的催化下产生葡萄糖酸和H2O2，紧接着H2O2能与显色剂ABTS在HRP的催化下产生明显的绿色物质ABTS·+。取3 μL的葡萄糖溶液滴加到mCNPs纸芯片上，反应30 s左右，使用智能手机摄像头拍摄显色照片。用Image -J软件分析照片的灰度值变化(ΔIntensity%)，建立葡萄糖浓度与显色灰度值的线性关系。ΔIntensity%的计算公式如下：

(1)

其中，Incontrol是指空白溶液滴加到纸芯片上的灰度值，Insample是指将样品溶液滴加到纸芯片上后测得的灰度值。

1.5 真实样品检测

使用0.05 mol/L的磷酸盐缓冲溶液(PBS，pH=7.4)将血清样本稀释10倍。取3 μL稀释后的溶液滴加到mCNPs纸芯片上，反应30 s左右，使用智能手机摄像头拍摄显色照片。使用Image -J软件分析ΔIntensity%后，代入线性关系公式即得血清中的葡萄糖浓度。将所测得的浓度结果与临床测试方法(全自动生化分析仪，罗氏Cobas，c702)所得结果进行比对。

2 结果与讨论

2.1 mCNPs纸芯片的表征

对mCNPs的纸芯片进行扫描电镜(SEM)观察。如图2(a)和2(b)所示，mCNPs纸芯片较为粗糙，且能明显观察到颗粒负载于纤维表面上。图2(c)为空白纸芯片的能谱(EDS)图，出现了C和O元素的峰，这是因为纤维素为天然多糖，主要由C、O、H三种元素组成。图2(d)为mCNPs纸芯片的EDS图，除了C、O元素的峰外，还出现了明显的N元素的峰，说明酶蛋白负载在了纸纤维上。以上结果证明了mCNPs成功固载在了纸芯片上。

图2 mCNPs纸芯片的扫描电镜(SEM)图(a、b)；空白纸芯片(c)和mCNPs纸芯片(d)的能谱(EDS)图

2.2 试剂及样品的消耗体积的优化

纤维素纸的吸水能力是有限的。加入的酶溶液体积过少，无法浸满整个纸芯片，会造成检测结果不准确；加入酶溶液体积过多，超出纸芯片的吸水极限，溶液会溢出，造成浪费。因此，实验探究了纸芯片的极限浸润量。为了更直观的观察纸芯片的吸水情况，在碱性溶液中添加酚酞制成红色溶液，将不同体积的红色溶液滴加到纸芯片上，待完全浸透后用手机摄像头拍摄纸芯片的图像。如图3所示，1 μL和2 μL的酶溶液无法完全浸润纸芯片，4 μL和5 μL的酶溶液量过大，溶液有浸出现象，3 μL的酶溶液能使纸芯片刚好被完全浸润又不造成溶液浪费。因此，后续实验在纸芯片上的酶溶液滴加量选为3 μL。

图3 纸芯片的最佳溶液承载量探究

2.3 葡萄糖检测条件的优化

实验优化了酶的浓度和检测时间。如图4(a)所示，随着酶浓度的增加，显色强度逐渐增加，在GOX的质量浓度为4 mg/mL时，显色强度达到最大。因此，酶浓度被优化为4 mg/mL。如图4(b)所示，随着时间的增加，显色强度逐渐增大，在显色时间为30 s时，显色强度达到饱和。因此，将检测时间定为30 s。

图4 GOX浓度(a)和检测时间(b)的优化

2.4 比色法检测葡萄糖的性能评估

在优化的条件下检测葡萄糖，建立显色强度与葡萄糖浓度的线性关系。如图5(a)所示，随着葡萄糖浓度的增加，生成的绿色产物ABTS·+增多，因此mCNPs纸芯片上的绿色越深。在0.1～3.0 mmol/L的葡萄糖浓度范围内，显色强度ΔIntensity%(y)与浓度(x)呈良好的线性关系(图5(b))，线性方程为：y=23.721x+4.487(R2=0.9940)。使用3倍信噪比(S/N)的计算方法对本研究的检测限(LOD)进行计算，算得LOD为0.01 mmol/L。

图5 (a)不同浓度葡萄糖与纸芯片的显色图像；(b)检测葡萄糖的标准曲线

与已经报道的酶基比色试纸进行性能比较，结果如表1所示。本方法的检测限和检测速度优于大部分已发表的研究工作。

表1 本方法与其他葡萄糖比色试纸的性能比较

2.5 重现性和选择性

为了探究mCNPs纸芯片检测葡萄糖结果的重现性，在相同的实验条件下，对1 mmol/L的葡萄糖溶液进行了6次平行测定。结果如图6(a)所示，显色强度保持高度一致，计算相对标准偏差(RSD)为1.3%。这种较高的结果重现性可以归因于移液加样的方法提高了纸芯片的检测结果的可靠性。考虑到实际检测时样本中可能含有干扰物，配制了2 mmol/L的不同干扰物(NaCl、KCl、牛血清白蛋白、L-抗坏血酸和琼脂糖)用于鉴定纸芯片检测葡萄糖时的选择性。结果如图6(b)所示，只有在样本为葡萄糖时，纸芯片才能观察到明显的颜色变化。以上结果说明mCNPs纸芯片具有良好的结果重现性和葡萄糖选择性。

图6 mCNPs纸芯片比色检测葡萄糖的重现性(a)和选择性(b)

2.6 稳定性

为了探究mCNPs纸芯片在高温环境下的稳定性，将其置于40 ℃的恒温箱中1～5 h后，滴加1 mmol/L的葡萄糖溶液观察其显色情况。将等量的游离酶滴加在干燥在纸芯片上，制备成游离酶纸芯片作为对照。如图7(a)所示，在高温环境下长时间放置后，游离酶纸芯片的酶活性明显下降，而mCNPs纸芯片表现出更优的酶活稳定性。为了探究mCNPs纸芯片的长期储存性能，将mCNPs纸芯片和游离酶纸芯片同时置于室温条件下密闭放置7 d，每天检测其对1 mmol/L的葡萄糖溶液的显色情况。结果如图7(b)所示，在长期储存下，mCNPs纸芯片的酶活保存情况良好，而游离酶芯片活性明显下降。以上的结果可以归因于PEG化的方法增强了酶的耐热性和储存稳定性。

图7 mCNPs纸芯片与游离酶纸芯片的耐热性(a)和长期储存性(b)对比

2.7 实际样品检测

采用本方法检测了成都市某人民医院提供的3名糖尿病人的血清样本。如表2所示，本方法的检测结果与临床检测的结果高度吻合，重现率在97.52%～101.76%之间，RSD在0.9%～1.1%之间。这说明本方法用于血糖检测时，结果精准可靠，具备一定的应用价值。

表2 糖尿病患者血清中葡萄糖的测定结果

3 结论

本研究利用PEG化技术合成了mCNPs，并制备mCNPs纸芯片用于葡萄糖的快速比色法检测。这种mCNPs纸芯片克服了游离酶制备的比色试纸稳定性差的缺点，具有成本低、操作简单、灵敏度高、响应快速、稳定可靠等优点，可用于真实血清样本的检测，为临床测血糖和食品、药品及化工等领域的葡萄糖现场即时检测提供了一个新方法。