微波法制备的茶籽壳基磁性生物质活性炭富集水样中的微囊藻毒素

王振峰， 王学东， 鲍秀敏， 李镕基， 黄 金， 高仕谦*

( 1.温州医科大学公共卫生与管理学院，浙江温州 325035;2.苏州科技大学环境科学与工程学院，江苏苏州 215009;3.苏州科技大学天平学院环境工程系，江苏苏州 215009)

加强农业废料的综合开发和资源再生已成为农业的热点问题[1]。茶籽壳占油茶果实质量的50%～60%，是农业的重要废料之一，其中木质素含量约为42.2%，可与纤维素、半纤维素相互交联形成良好的木质素-碳水化合物复合体[2,3]，为制备功能型生物质炭提供了必要的物理化学条件[4]。生物质炭孔隙率较高、比表面积大、化学性能稳定，对环境介质中的金属和持久性有机污染物具备良好的吸附/催化性能[5 - 7]。

近年来，水体富营养化日益严重，其中藻细胞死亡后释放出的单环七肽化合物微囊藻毒素(Microcystins，MCs)对生物肝脏造成潜在威胁，人体长期暴露于低浓度水平时即存在致癌的风险，高浓度时可致肝细胞肿胀，甚至坏死[8]。世界各国和相关国际组织严格制定了饮用水中MCs的限制标准，世界卫生组织(WHO)和我国国家标准(GB/T20466-2006)均对饮用水中MCs的浓度作了严格的限定，浓度不高于1.0 μg·L-1。由此可见，建立一种MCs的高选择性富集及精准分析方法，以实现对水环境中MCs的快速检测和控制迫在眉睫。

目前处理水体中 MCs 的方法主要有吸附法[9]、化学氧化剂法[10]和生物降解法[11]等。活性炭以其比表面积比较大、经济、易得等优势在快速吸附环境水体中持久性有机污染物的研究中得到拓展[12]。普通热源法是炭化活性炭的主要形式，使热由原料外表面向内里渗透，使材料体形成温度梯度，活化体主要停留在外表面，导致生物炭获得率比较低。而微波辐射法采用电磁能瞬间“中间心”加热模式，使其受热均匀[13]、节省时间、能耗低，近来在生物炭等各方面得到广泛应用。本实验以茶籽壳为原料，H3PO4作为活化剂，Fe3O4为磁性添加剂和微波吸收介质，采用微波辅助法制备磁性生物质活性炭(MBAC)材料，考察了多种因素的影响，用亚甲基蓝吸附值评价MBAC中的孔率及微孔率，以获得较优的工艺条件。将该MBAC材料应用于水样中的微囊藻毒素(MC-LR、MC-RR)的富集，并对影响富集效率的各个因素进行优化，以获得最优的富集条件；将该材料应用于本市内实际环境水中微囊藻毒素的富集，考察该磁性纳米材料对未经过滤和过滤后的实际环境水体中微囊藻毒素的富集效率。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

TSQ Quantum Ultra EMR三重四极杆质谱仪和Ultimate 3000超高效液相色谱仪(美国，Thermo 公司)；UWave-2000多功能微波合成萃取仪(上海新仪微波化学科技有限公司)；BJ-800A多功能粉碎机(浙江德清拜杰电器有限公司)。

微囊藻毒素(MC-LR、MC-RR，纯度大于95%，美国Standford Chemicals公司)标准储备溶液的质量浓度为50.0 mg·L-1。甲醇、乙腈(色谱纯，美国Tedia公司);甲酸(色谱纯，上海阿拉丁生化科技股份有限公司);H3PO4(分析纯，西陇化工股份有限公司)；FeCl3·6H2O(分析纯，国药集团化学试剂有限公司)；无水乙醇(分析纯，无锡晶科化工有限公司)。实验用水为Milli-Q(美国Millipore公司)超纯水。

茶籽壳去尘、洗净、风干后，待用。

1.2 色谱-质谱条件

色谱条件：色谱柱为Agilent Eclipse XDB-C18柱(50 mm×3.0 mm，1.8 μm)，柱温 25 ℃。流动相：A为甲醇，B为 0.1%甲酸溶液。梯度洗脱：0～3.0 min，5.0%～95.0%A；3.0～4.5 min，95%～98.0%A；4.5～5.5 min，98.0%～5.0%A。流速:0.4 mL·min-1；进样量：5.0 μL。

质谱条件：电喷雾离子源，正离子模式(ESI+)扫描；扫描方式：选择反应监测(SRM)；正极喷雾电压：3 500 V；负极喷雾电压：3 000 V；毛细管温度：300 ℃；鞘气压力：35 MPa；辅助气压力：15 MPa；碰撞气压力：1.5 mTorr。色谱-质谱条件如表1所示。

1.3 MBAC的制备

1.3.1 Fe3O4磁性纳米粒子的制备准确称取6.74 g (0.025 mol) FeCl3·6H2O和14.37 g (0.104 mol) 无水NaAc，溶解于125 mL 的17.931 mol·L-1乙二醇中，超声30 min得黄色均相透明溶液。将上述溶液转移至高压反应釜内，于200 ℃反应8 h，缓慢冷却至室温。在外加磁场作用下，用超纯水和无水乙醇交替清洗三遍，60 ℃真空干燥8 h，得Fe3O4磁性纳米粒子，待用。

1.3.2 微波辐射法制备MBAC采用微波方法制备MBAC。洁净茶籽壳于105 ℃下干燥3 h，研磨、过筛。将50%的H3PO4与150目茶籽壳粉末以5∶1(V/m)比例混合，于105 ℃下活化24 h。将已活化生物质炭与Fe3O4磁性粒子按5∶2的质量比混合均匀，于N2保护下，500 W微波碳化40 min，得到初产物。用0.1 mol·L-1HCl浸泡去除灰分，用超纯水洗至中性，105 ℃ 真空干燥12 h，取出，研磨得MBAC。

1.4 磁性固相萃取过程

1.4.1 MBAC吸附亚甲基蓝移取5 mg·L-1的亚甲基蓝溶液10.0 mL于离心管中，投加 5.0 mg MBAC，磁力搅拌20 min 使MBAC充分吸附亚甲基蓝，而后进行磁性分离。取上清液经0.22 μm有机滤膜过滤，滤液于662 nm波长处进行测定。根据亚甲基蓝标准曲线：y=0.1719x+0.0024，计算MBAC对亚甲基蓝的去除效率。

1.4.2 MBAC吸附微囊藻毒素取100 mL水样于锥形瓶中，用冰HAc调节pH到4.0，称取10.0 mg MBAC加入到上述水样中，高速磁力搅拌20 min。弃去上清液，外加磁场回收MBAC。以1.0 mL甲醇(8%氨水)涡旋洗脱1.5 min，收集洗脱液。上述洗脱过程重复3次，合并洗脱液，N2吹挥至近干。用初始流动相复溶至1.0 mL，用0.22 μm有机滤膜过滤，滤液经超高效液相色谱-串联质谱法(UHPLC-MS/MS)分析。

2 结果与讨论

2.1 材料制备条件的优化

2.1.1 茶籽壳粉末粒径茶籽壳粒径是影响MBAC吸附性能的因素之一。如图1，随着茶籽壳粉末从60目增加到150目，MBAC对亚甲基蓝的吸附效率呈上升趋势。这是因为茶籽壳粉末粒度减小，比表面积增大，H3PO4与茶籽壳粉末的接触面积增大，可形成更多的微孔或中孔，增强MBAC吸附能力。继续增大到200目，MBAC吸附效率基本恒定。实验确定茶籽壳粉末目数为150目。

2.1.2 H3PO4体积分数实验对H3PO4的体积分数和与生物质炭的浸渍比进行考察，如图2(a)和2(b)所示。H3PO4体积分数增大到50%，MBAC的吸附效率不断上升，继续增加体积分数，吸附效率呈下降趋势。这是因为H3PO4体积分数较小时，剂量不充足，对造孔作用有限，致使MBAC孔隙率降低；随着H3PO4体积分数的增加，促进MBAC微孔及中孔的快速形成；H3PO4体积分数过高时，过量的H3PO4可能会使微孔和中孔进一步扩大，导致MBAC吸附性能下降。本实验最佳H3PO4体积分数选为50%。

50%H3PO4与MBAC按体积(mL)/质量(g)比进行混合，考察浸渍比对吸附效率的影响。50%H3PO4与MBAC浸渍比增大到5∶1(V/m)时，MBAC的吸附效率随之增加，这是因为浸渍比增大，H3PO4量增大，与茶籽壳粉末充分作用，有利于孔隙的形成，使MBAC的吸附性能增强。随着浸渍比的继续增加，MBAC的吸附效率下降。因此本实验选择最佳浸渍比为5∶1。

2.1.3 Fe3O4投加量在微波场中碳含量的增加，可使相对介电常数增加，即介电实部ε′更小，虚部ε″更大[14]，电磁波的阻抗匹配增大，电磁波进入材料内部的可能性增加，进而提高微波利用率。Fe3O4是良好的微波吸收介质，在微波场中，减小磁导率实部μ′，增大虚部μ″[15]，可提高微波利用率，增加碳化率。经H3PO4活化后的MBAC表面带有O=P-OH键，Fe3O4表面带有羟基，两者可通过配位体交换自组装结合，并且在微波场作用下带电的Fe3O4与H3PO4之间存在弱电吸附作用。如图3所示，Fe3O4投加量2.0 g时吸附效率最高，继续增加用量，MBAC的吸附性能反而下降。实验选用2.0 g为Fe3O4最佳投加量。

2.1.4 微波功率实验考察不同微波功率对MBAC碳化率的影响，如图4所示。当微波功率从 300 W 增加到500 W，MBAC的吸附效率不断增加，这是因为微波功率的增加，ε′，μ′和μ″均有所降低，频散特性较好，偏磷酸等磷酸衍生物与木质素各单元形成一定的孔隙，但在较低温度时形成的孔隙较宽；当微波功率处于500 W附近时，中孔继续形成的同时部分开始收缩形成微孔，进而使比表面积增大；但是过高的温度使中孔和微孔均发生收缩现象，同时可能出现芳香环的过度聚合，致使孔体积和比表面积均出现下降的趋势。本实验最佳微波功率为 500 W。

图4 微波功率对MBAC吸附效率的影响

2.2 材料的表征

采用扫描电镜-能谱(SEM-EDS)和透射电镜(TEM)对MBAC的表面形貌进行表征。H3PO4活化后的茶籽壳粉末组织比较致密，表面比较光滑(图5(a))。而经碳化后的MBAC表观形态发生改变，空隙量增加 (图5(b))。在磁性改性过程中，Fe3O4与生物质炭表面的强结合是通过Fe3O4与被处理材料表面之间的范德华力、静电引力和疏水相互作用而实现。由图5(c -d) SEM-EDS所示，C、O、P 和 Fe元素的质量分数分别为17.3%、40.3%、14.0%和28.4%。图5(e)TEM图显示，可观察到明显的Fe3O4磁核，在外加磁场的条件下，MBAC可以有效地与基质分离。MBAC的BET/BJH测试如图5(f)所示，比表面积约为222.9 m2·g-1，平均孔径大小约为2.4 nm，孔容约为0.083 cm3·g-1。

图5 经H3PO4活化的茶籽壳(a)和微波碳化的MBAC(b)的扫描电镜(SEM)图、SEM-EDS (c -d)、TEM (e) 和BET/BJH图(f)

MBAC的红外光谱表征如图6所示。3 419.23 cm-1是-OH 的特征吸收峰，3 101.63 cm-1为烯烃中的 C-H 的伸缩振动引起的吸收峰，2 924.78 cm-1和 1 229.62 cm-1为 CH3和-CH 的特征吸收峰，1 269.65～1 121.28 cm-1和1 180 cm-1处的峰可以归因于磷酸盐或多聚磷酸盐的P-OOH和P-O基团的氢键伸缩振动，以及P-O-C(芳香)键上的O-C伸缩振动。970.64 cm-1为 C=O 伸缩振动引起的吸收峰，735.13 cm-1处的波段表明芳香环中存在 C-H 弯曲，547.76 cm-1为 Fe-O 伸缩振动引起的吸收峰。说明MBAC纳米材料含有C、H、O、P 和 Fe等元素。

图6 MBAC的红外光谱图

2.3 磁性固相萃取条件优化

2.3.1 MBAC的用量实验探究MBAC的投加量为5.0～25.0 mg时对MC-RR和MC-LR萃取效率的影响，如图7(a)所示。当MBAC用量从 5.0 mg 增加到 10.0 mg时，对MCs的萃取效率也随之增大，当投加量为 10.0 mg时，对于MC-RR和MC-LR的富集效果达到较优值。当MBAC投加量继续增大时，MCs的萃取效率略有降低。因此选择10.0 mg的MBAC作为固相萃取吸附剂用量。

2.3.2 水样pH和离子强度溶液的pH直接影响吸附剂与吸附质之间的表面电荷分布[16]。探究pH在2.0～8.0范围内MBAC对MCs萃取率的影响。如图7(b)所示，随着pH从2.0增大到4.0，MC-LR和MC-RR的回收率都在上升，当pH为4.0时，MBAC对MCs的富集效果最好；而后随着pH 的继续增大，溶液从酸性变为中性之后变为碱性，MBAC表面正电荷密度逐渐降低，静电作用减弱，导致其对MCs的萃取效率会逐渐降低。因此选择4.0为最佳pH。

图7 MBAC用量(a)和pH (b)对萃取效率的影响

探究离子强度对MCs 萃取效率的影响。实验结果表明，水样的离子强度对MC-LR 和MC-RR 的萃取回收率的影响可忽略不计，即离子强度对实验影响不大，所以在接下来的实验选择不添加NaCl。

2.3.3 萃取时间探究不同萃取时间(5、10、20、30 、40 min)对MCs萃取效率的影响。由图8所示，随着萃取时间从5 min 增加到20 min，MCs 的回收率总体上在不断增大；在20 min 时，MC-LR 和MC-RR的回收率都处于最大值，此时MBAC与MCs之间达到吸附平衡；随着萃取吸附时间的继续增加，MCs 的回收率基本保持恒定。因此，固相萃取吸附时间选为20 min。

图8 萃取时间对萃取效率的影响

2.3.4 洗脱剂种类考察了不同洗脱溶剂甲醇、乙腈、丙酮和不同百分比氨水作添加剂的甲醇对MCs洗脱效果的影响，结果如图9所示。丙酮并不能有效地将MCs从MBAC表面洗脱下来，洗脱效果较差；而甲醇和乙腈相比，甲醇的洗脱效果更好；当甲醇中添加一定比例的氨水后，发现洗脱效果明显增强，MC-RR和MC-LR的回收率都达到最高。因此选择甲醇作为洗脱剂，其中氨水添加比例为8.0%。

图9 洗脱剂种类对回收效率的影响

2.3.5 洗脱剂体积实验设计洗脱剂体积分别为 0.5 mL×3、 1.0 mL×3、1.5 mL×3 和 2.0 mL×3，探究洗脱剂体积对MCs回收率的影响。研究表明1.5 mL的洗脱剂由于量太少，并不能充分洗脱MBAC表面吸附的MCs；当增加到3.0 mL，由于洗脱剂的体积充分，洗脱效果增强，所以回收率明显增大，MC-RR的回收率最高。综合考虑，本实验的洗脱剂体积为1.0 mL，平行洗脱3次，每次1.0 min。

2.4 方法评估

配制系列混合标准溶液(1.0、2.0、4.0、6.0和10.0 μg·L-1)，在最佳萃取条件下进行富集，在确定的色谱-质谱条件下测定，建立色谱峰面积(y)对标准溶液的浓度(x,μg·L-1)的线性关系，结果见表2。实验数据显示，在 1.0～10.0 μg·L-1范围内，MC-LR的浓度与色谱峰面积呈现良好的线性，检出限(LOD)为0.073 μg·L-1，相关系数为0.9953；在 0.1～10.0 μg·L-1范围内，MC-RR的浓度与色谱峰面积线性关系良好，LOD为0.016 μg·L-1，相关系数为 0.9904。

表2 微囊藻毒素的线性方程

2.5 实际水样的测定

以某市3条内河水体为研究对象，于6～9月份期间每周采集一次水样，采用该方法对实际环境水体中的MCs进行浓度评估。研究结果表明，实际水体中MC-RR的浓度范围为51.2～56.6 ng·L-1，MC-LR未检出。

表3 某市6～9月份实际环境水样中微囊藻毒素的平均浓度

3 结论

本实验选择富含高比例木质素的农业废料茶籽壳为碳源，以Fe3O4作为赋磁剂和微波吸收介质，采用微波辐射技术制备磁性茶籽壳基磁性生物质活性炭。采用磁性固相萃取法实现对水样中的微囊藻毒素进行富集，并以超高效液相色谱-串联质谱法对其进行定量测定。该方法的检出限低于世界卫生组织(WHO)的规定标准。制备该磁性纳米材料具有节约时间、原料经济、富集过程简便的优点。