LC-MS/MS检测豆芽中的4种植物生长调节剂

2022-04-12黄景怡王宗义黄丁偎董子琦张嘉彤

北京农学院学报 2022年2期

黄景怡，郭凯，王宗义，闫珺，黄丁偎，董子琦，张嘉彤，魏朦

(北京农学院食品科学与工程学院/食品质量与安全北京实验室/农产品有害微生物及农残安全检测与控制北京市重点实验室，北京 102206 )

豆芽，俗称豆芽，是人们日常生活重要的食材之一。近年来，豆芽中植物生长调节剂(PGRs)残留问题受到了人们的广泛关注[1]。PGRs作为一类人工合成的激素农药，具有提高作物产量和改善产品品质的作用[2]，但过量的PGRs残留，容易导致儿童早熟、女性生理改变、老年人骨质疏松等，影响生殖和代谢，甚至有致癌、致畸的作用[3-5]。2014年，中国开始不受理PGRs在豆芽制发中使用的登记申请[6-7]；2015年4月, 又明确规定6-苄基腺嘌呤(6-BAP)、4-氯苯氧乙酸(4-CPA)和赤霉素(GA)等不在豆芽生产可使用的范围[8]。但近年来豆芽中PGRs仍有不同程度检出的报道[9-12]，因此，建立豆芽中典型PGRs的简便可靠测定方法, 对提高相关食品安全监管效率具有实际意义。

目前，关于豆芽中PGRs的检测方法主要有气相色谱法(GC)、高效液相色谱法(HPLC)[13-14]和液相色谱-串联质谱法(LC-MS/MS)[10-11, 15]等；其中GC法需要衍生化处理，较为繁琐，HPLC法通常灵敏度和选择性不足，LC-MS/MS法是近年来报道较多的方法，具有高灵敏、高选择的特点，但容易受基质效应的影响，需要优化合理的样品前处理方法。本研究，在Sutcharitchan等[16]检测三七中多种PGRs的基础上，针对豆芽样品进行了适当方法改进，建立了豆芽中4-CPA、6-BAP，GA和2,4-D等常被检出PGRs的高效检测方法。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

黄豆、绿豆、黄豆芽、绿豆芽(北京地区超市和农贸市场)；50-mL塑料离心管(BD Biosciences公司)。

分析纯无水硫酸镁、氯化钠、柠檬酸三钠、柠檬酸二氢钠(国药集团化学试剂有限公司)；色谱纯乙腈、甲醇、甲酸、乙酸铵(美国J．T．Baker公司)； 4-CPA(济南中天组培有限公司)、GA、6-BAP、2, 4-D(上海源叶生物有限公司)。

1.2 仪器与设备

Agilent6410B液相色谱-串联质谱联用仪(美国Agilent Technologies公司)；Centrifuge 5810 R高速冷冻离心机(德国Eppendorf公司)；KQ-500 DE超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)；800 A型样品均质机(天津泰斯特仪器有限公司)；MS 3基本型漩涡混匀器(艾卡(广州)仪器设备有限公司)；Heal Force纯水机(默瑞(上海)生物科技有限公司)。

1.3 样品前处理

将采集好的新鲜豆芽用榨汁机打成糊状，准确称取10 g(精确到0.001 g)于50 mL离心管中，加入20 mL乙腈，涡旋混匀1 min，超声10 min，冷却至室温后加入4.0 g MgSO4、1.0 g NaCl、1 g Na3Cit·2H2O和0.5 g Na2HCit·1.5 H2O，再次涡旋混匀、超声10 min，冷却至室温后，9 500 r/min离心5 min，取部分上清液过0.22 μm的有机滤膜后，再取部分滤过液加等体积的去离子水混合后，装入至进样瓶中待测。

1.4 标准溶液的配制

分别准确称取4-CPA、GA、6-BAP、2,4-D标准品各10 mg，分别于10 mL容量瓶中, 用甲醇定容, 得1.0 mg/mL各标准储备液，于-18 ℃保存。

用甲醇稀释标准储备液，获得浓度均为10 μg/mL(加标回收试验用)和1 μg/mL混合标准中间工作液于4 ℃保存，使用时放置到室温。

分别取5 mL空白黄豆芽样品提取液于10 mL容量瓶中，再分别加入1 μg/mL的混合标准工作液各 2 000、1 500 、1 000、500、200和100 μL，用去离子水定容至刻度，得200、150、100、50、20和10 ng/mL的系列标准混合溶液。同样方法配制绿豆芽样品基质系列标准混合液。

1.5 分析条件

色谱分离：色谱柱为Waters XEELECTTM HSS T3 (3.5 μm, 2.1 mm×150 mm)；流动相A为含0.1%甲酸水溶液；流动相B为乙腈；梯度洗脱程序为35%的B保持2.5 min，然后1.5 min 线性升至80%，保持7 min, 重新回到35%，平衡色谱柱7 min；进样体积20 μL; 柱温40 ℃; 流量0.3 mL/min。

质谱检测： ESI+电离源，雾化电压15 psi，去溶剂氮气温度为300 ℃、流量10 L/min，碎裂电压135 V；多重反应监测(MRM)模式质谱检测，各化合物的前级离子质荷比，定量产物离子质荷比(碰撞能)，定性产物离子质荷比(碰撞能)分别为：6-BAP，m/z226、m/z91(20 eV)、m/z226(0 eV); 4-CPA，m/z185、m/z127(10 eV)、m/z129(10 eV)；GA s，m/z345、m/z239(15 eV)、m/z143(15 eV)；2,4-D，m/z219、m/z161(20 eV)、m/z125(20 eV)。

1.6 数据处理

使用MassHunter B.07.01数据处理软件，对目标物保留时间、母离子及两个二级离子响应比值与标样相应参数进行对照，进行定性；建立基质标准曲线，外标法进行定量，定量计算公式:w=c×V×n/m，其中w为试样中待测物含量(mg/kg),c为最终样品溶液中待测物的浓度(ng/mL)，V为提取液体积(mL)，n为稀释倍数，m为样品质量(g)。

2 结果与讨论

2.1 色谱与质谱条件的优化

在不接色谱柱的条件下分别用浓度为1 000 ng/mL的标准溶液进行全扫，找到每个目标物的前级离子，然后在不同碰撞能条件下进行碎片离子扫描，确定每个化合物的碎片离子。试验发现，4-CPA和6-BAP仅能获得1个相对丰度较大的碎片离子，因此，根据Cl元素有较大的27Cl同位素丰度的特点，分别使用185和187做前级离子，而6-BAP则使用其前级离子在碰撞能为0 V时做为碎片离子之一，进行MRM条件设置，获得较好效果。

在优化的MRM参数下，比较了0.1%甲酸-乙腈，0.1%乙酸-乙腈，0.1%甲酸-甲醇，0.1%乙酸-甲醇的分离效果和流动相对检测信号响应的影响。试验发现，0.1%甲酸-乙腈，效果最好，乙酸虽然使4-CPA等负离子模式检测的目标物响应有所增加，但分离效果不佳，甲醇则洗脱时间较长，故选择0.1%甲酸-乙腈进行梯度洗脱。黄豆芽和绿豆芽样品基质对分离没有影响，典型MRM色谱图如图1所示。试验为排除基质效应的影响，使用基质匹配标准溶液建立标准曲线。

2.2 样品前处理方法的改进

Sutcharitchan等[16]使用水-乙腈提取，结合盐析做用，进行样品前处理，检测了中药三七中39种植物生长调节剂，样品前处理方法较为简单实用。不同于中药材，豆芽含有大量的水分，因此豆芽样品可直接进行乙腈提取，不需要加入水。试验发现，样品经乙腈提取，硫酸镁脱水后的提取液，直接进样分析，色谱峰展宽严重，色谱效果较差；将提取液用水稀释到两倍体积时，色谱峰型变好(图1)。固本试验，采用样品提取前不加水，而提取后，加水稀释进样的样品处理方式，获得了理想的试验效果。

图1 豆芽基质中4种待测目标物的MRM色谱图Fig.1 The MRM chromatograms of 4 PGRs in soybean sprouts

2.3 线性、检出限和定量限

结果(表1)显示黄豆芽和绿豆芽基质中验证浓度为10～200 ng/mL，标准曲线线性良好，R2>0.995。分别以3倍信噪比和10倍信噪比计算检出限(LOD)和定量限(LOQ)，结果见表3，LOD为0.07～5.62 μg/kg，LOQ为0.25～18.74 μg/kg。

表1 线性、检出限和定量限TableTab.1 Linearity, LOD and LOQ

2.4 加标回收率与精密度

按1.3小节的样品处理方法，称样后分别加入10 μg/mL的混合标准工作液20 μL、50 μL和150 μL，获得20、50、150 μg/kg的样本，每个水平6个重复，涡旋混合30 s，然后按1.3小节后续处理方法处理，并检测，结果见表2。4种目标物的回收率为73.81%～109.57%, 相对标准偏差RSD为3.71%～16.88%，符合化学分析方法验证确认和内部质量控制实施指南要求[17]。

表2 加标回收率与精密度(n = 6)Tab.2 Recoveries and precisions(n = 6)

2.5 实际样品的检测

采集超市和农贸市场上豆芽产品50个，其中黄豆芽28个，绿豆芽22个，应用本试验建立的检测方法进行检测。4-CPA，GA，2,4-D均未检出，6-BAP有28个黄豆芽检出，16个绿豆芽检出，总检出率为88%，但含量较低，均在LOD水平。说明6-BAP在豆芽生产中在普遍使用，也有可能是来源于环境污染，结果还尚有待进一步确认。