高温胁迫下叶用莴苣核体系酵母文库构建与鉴定

李云峰，李振峰，杜 杨，韩莹琰，刘超杰，郝敬虹

(北京农学院 植物科学技术学院/农业应用新技术北京市重点实验室，北京 102206)

叶用莴苣，俗称生菜，菊科莴苣属。根据联合国粮食及农业组织的数据，2019 年全球生菜和菊苣的产量超过 2 900 万吨，在所有叶类蔬菜中排名第三。生菜因其品种多样、口味多样、营养价值高、富含维生素、叶酸和矿物质而在全球广受欢迎。生菜已成为研究菊科及相关植物的典范。但是叶用莴苣作为一种高温敏感型叶用蔬菜，在高温的胁迫下极易向生殖生长转变[1]。当外界环境温度超过30 ℃时，就会导致先期抽薹，造成生菜产量和食用价值的下降。

在外界环境条件以及植物自身遗传因素的影响下,常常会导致花芽分化提前的现象,造成植物的先期抽薹[2]。宋有金等发现热胁迫对开花有促进作用[3]。植物对高温胁迫的响应是一个极其复杂过程,当外界温度升高时,细胞膜上的胁迫感受器膜蛋白通过信号传导途径传递至细胞核，从而影响相关基因的表达[4]。由此可知,高温胁迫应答信号可以引起高温胁迫应答信号通过传导神经途径细胞中的多种抗体基因组的表达,参与抑制调控莴苣植物多种抗体的高温胁迫应答[5],但是在应答调控过程中许多未知调控机制理论反应机制尚不清楚,挖掘和研究探讨这些未知调控机制对深入研究叶用莴苣的抗高温反应调控机制具有重要理论意义。

核体系酵母文库的建立对研究蛋白间相互作用意义重大。李紫良通过酵母单杂试验证明了TaTMS5是TaERF7的下游靶基因,得出高温和长日照条件时,小麦中TaERF7基因表达量降低,同时对TaTMS5的抑制作用减弱结论[6]。原贵波等通过酵母双杂交技术找到了SlMPK1的互作蛋白SlVQ6蛋白,并通过GST pull-down技术验证SlMPK1与SlVQ6的互作,为研究SlVQ6介导的高温应答信号通路奠定基础[7]。Distelfeld等通过酵母三杂交试验证明在植物中,VRN2与三种 NF-YB 蛋白中的两种之间的相互作用[8]。由此可知,建立一个高质量的叶用莴苣核体系酵母文库对探究高温胁迫下叶用莴苣机制起到至关重要作用。

GB-30是作为高温条件下极易抽薹品种，可作为模拟夏季高温胁迫下生菜发生抽薹现象的代表品种，通过对其35 ℃高温处理8 d后，取其茎尖以及叶片采用Geteway方法建立cDNA文库，为后续探究高温胁迫下叶用莴苣抽薹相关机制奠定基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料

GB-30叶用莴苣材料由北京农学院植物科学技术学院园艺学生菜课题组提供，试验材料种植于人工气候培养箱。生长条件可参照生菜最适温度[9]。待幼苗长至6叶1心时对试验材料进行高温胁迫处理。高温处理条件为：光强以及光照不变，温度提升至白天33 ℃，晚上25 ℃。取8 d高温处理的茎尖和新生叶片1 g等量混合，进行液氮速冻，并对其立刻进行RNA提取，此为高温胁迫下GB-30生菜核体系酵母文库构建试验材料。

1.2 叶片总 RNA 提取与 mRNA分离纯化

对高温处理的样品混样，进行总RNA提取，采用CTAB法。接着对 mRNA进行分离纯化(具体可参考Oligotex mRNA Midi Kit说明书)。总RNA用DEPC水溶解至体积为500μL；500 μL buffer OBB和55 μL Oligotex suspension；70 ℃，5 min；25 ℃，30 min；12 000 r/min,2 min；去除上清;加入400 μL 洗脱液(OW2)；混匀后转到吸附柱,12 000 r/min,1 min；重复1次；加入70 μL buffer OEB (70 ℃)；12 000 r/min,1min；重复mRNA。向分离后的mRNA加入NH4OAC，无水乙醇以及糖原，-80 ℃,25 min；4 ℃，13 000 r/min,20 min；加1 mL 70%乙醇25 ℃，离心，去除上清；空气中晾干，7 μL水，即为纯化后的mRNA。

1.3 叶用莴苣酵母双杂交初级cDNA文库构建

1.3.1 cDNA第一链的合成 取适量纯化后mRNA，按照试剂盒加入biotin-attB2-Oligo(dT) Primer 1 μL,dNTPs 1 μL，70 ℃ 5 min，45 ℃ 2 min。之后加5×First Strand Buffer，4 μL；DTT(0.1 M)2 μL；SuperScript III RT 适量,45 ℃ 20 min；50 ℃ 20 min；55 ℃ 20 min。

1.3.2 cDNA第二链的合成 在上述反应液中加入DEPC-treated water 91 μL,5 X Second Strand Buffer,30 μL,10 mM(each)dNTPs 3 μL,E.coli.DNA Ligase(10 U/μL) 1 μL,E.coli.DNA Polymerase I(10 U/μL) 4 μL,E.coli.RNaseH(2 U/μL) 1 μL, 补水至150 μL。16 ℃，2 h； 加入T4 DNA Polymerase 2 μL，16 ℃，10 min；加入0.5 M EDTA (pH=8.0)10 μL，补水至300 μL；加入酚∶氯仿∶异戊醇(25∶24∶1) 300 μL，混匀，静置1 min；14 000 r/min离心5 min，取上清液于新的离心管中，加入Glycogen (20 μg/μL) 1 μL，5 M 醋酸胺150 μL,100% ethano,1 125 μL，-80 ℃，15 min；14 000 r/min，4 ℃，25 min；去上清；加入1 mL 70%乙醇；14 000 r/min，4 ℃，离心3 min，去上清；重复1次； 室温25 ℃晾干cDNA；用104 μL DEPC溶解cDNA。

1.3.3 cDNA与三框attB1重组接头连接(3种接头分别各连接1份) 先将attB1 Adapter (1 μg/μL) F，4.5 μL，attB1 Adapter (1 μg/μL) R 4.5 μL，10×NEB Buffer 2 1 μL，95 ℃，5 min, 25 ℃，45 min。加入cDNA 34 μL，10×Ligation Buffer 5 μL，T4 DNA Ligase(1 U/μL) NEB 1 μL，16 ℃，24 h。

1.3.4 cDNA分级分离及收集 向分级柱中加入0.8 mLTEN Buffer清洗柱子，重复3次；将上诉制备好的3份50 μL的cDNA产物混匀加入柱子中，TEN Buffer 100 μL，收集滤液，向其中加入Glycogen (20 μg/μL) 1 μL, NH4OAc 0.5 μL，100% ethanol 2.5 μL，-80 ℃，15 min；14 000 r/min，4 ℃，25 min，去上清；70%乙醇 1 mL；14 000 r/min，4 ℃，3 min；去上清；重复1次；室温5 min ；DEPC 13 μL溶解cDNA，即cDNA分级分离及收集。

1.3.5 BP重组反应 取cDNA 13 μL,加入pDONR222(200 ng/μL)2 μL,BP Clonase© II enzyme mix 5 μL,补水至20 μL,25 ℃,20 h。在上述溶液中加入dd-water 80 μL,Glycogen (20 μg/μL)1 μL,5 M NH4OAc 50 μL,100% ethanol 375 μL,-80 ℃,15 min；13 000 r/min,4 ℃,25 min,去上清;70%乙醇1 mL,14 000 r/min,4 ℃,3 min，去上清；重复1次,室温晾干cDNA；TE Buffer 10 μL溶解cDNA；加入50 μL电转感受态细胞,冰上10 min,加入电转杯,冰上5 min;迅速加入SOC培养基4 mL;将电转物取入到新的15 mL离心管,37 ℃,2 250 r/min,1 h;之后涂布平板用于库容量鉴定;剩余培养物加入甘油至终浓度20%存于-80 ℃,此即为初级文库菌液。

1.4 高温胁迫下GB-30叶用莴苣酵母双杂交次级cDNA文库构建

将验证合格的Uncut文库,摇菌,30 ℃过夜培养,提取质粒建立LR重组反应:Uncut 文库质(300 ng/uL)1 μL, pGADT7-DEST (300 ng/μL)1 μL,LR Clonase II Mix 4 μL,ddH2O 14 μL,25 ℃,16 h。电转化大肠杆菌DH10B,同初级cDNA文库构建步骤一样,得到的即为次级文库菌液。

1.5 cDNA文库(Uncut型)文库质量鉴定

1.5.1 初级及次级文库库容量的鉴定 取转化后细菌原液10 μL稀释100倍后,从中取出50 μL涂布LB平板(初级文库抗性卡那霉素,次级文库抗性为氨苄青霉素),第2天计数。计数方法:CFU/mL=平板上的克隆数/50 μL ×100倍×1×103μL,文库总CFU= CFU/mL ×文库菌液总体积(mL)。

1.5.2 重组率和插入片段长度鉴定 随机挑取24个克隆进行菌落PCR鉴定，反应体系为dd H2O 16.2 μL，10×PCR Buffer 2.0 μL，dNTP(10 mM)0.5 μL，pDONR222F(20 μM)0.5 μL，pDONR222R(20 μM)0.5 μL，DNA Polymerase(5 U/μL)0.3 μL。PCR反应条件为94 ℃，5 min；94 ℃，30 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 2 min；25循环，72 ℃ 5 min。1 % Agarose凝胶电泳鉴定。

1.5.3 酵母文库质量鉴定 用5 μg作为酵母文库质粒中的一个转化子和Y187酵母质粒转化菌株,在每个直径为150 mm的平板上均匀横向铺展300 μL,共计100块平板。30 ℃倒置温育平板，从当天开始起一直到每个细胞克隆后的结果开始出现(3～6 d),4 ℃需要冷却倒置平板3～4 h,每个倒置平板每天需要连续加入5 mL已经冷冻后的细胞培养基,混匀,汇集所有细胞中的液体,计算每个细胞的密度,确定文库滴度。在温育平铺100 μL按照1∶100,1∶1 000,1∶10 000稀释液在酵母缺陷型培养基(SD-Leu)平板上,在30 ℃条件下，倒置温育平板直到每个细胞克隆结果开始出现。挑克隆,30 ℃,250 r/min,12 h；10 000 r/min,2 min,去上清。0.2% SDS,200 μL重悬菌液,25 ℃,15 min,离心；取1 μL上清液作为PCR模板,依次加入ddH2O 19.5 μL,10×Advantage 2 PCR Buffer 2.5 μL,50×dNTP Mix 0.5 μL,T7SP Primer 0.5 μL,3′ AD Primer 0.5 μL,50×Advantage 2 Polymerase Mix 0.5 μL,94 ℃,3 min,94 ℃，30 sec,55 ℃ 30 sec,72 ℃，2 min,35个循环,72 ℃ 5 min。PCR产物取5 μL用于电泳检测。

2 结论与分析

2.1 叶用莴苣mRNA与ds cDNA质量检测

mRNA结果显示条带在500～2 000 bp的范围内呈均匀性的弥散弹性分布,证明有效cDNA文库mRNA条带质量保持较好,未发生化学降解。ds cDNA条带在较大长度范围内结构呈弥散性均匀纵向分布,因此得出其cDNA条带结构完整性较好,质量性能较高,可用于构建高温胁迫下GB-30叶用莴苣酵母双杂交cDNA文库。

2.2 初级cDNA文库构建与鉴定

经生物学重复计算GB-30叶用莴苣核体系cDNA酵母文库平板上共长出1700个有效克隆,得到的初级cDNA文库平板滴度大约1.36×107cfu/mL。随机重组选取的4个插入克隆进行PCR检测,24个插入克隆结果显示均超出克隆条带,重组成功率平均为100%,该检测结果从一定很大程度上有效降低了该克隆假说的阳性。24个插入克隆全部扩增为5 00 bp以上,且每个插入克隆片段平均插入长度最大>1 000 bp(图1)。由此可 知,以上分析数据已经达到用于构建高温胁迫下GB-30叶用莴苣cDNA数据文库的标准。

图1 初级文库重组率鉴定Fig.1 Identification of recombination rate of Primary Library

2.3 核体系次级文库鉴定

经分析计算GB-30叶用莴苣次级酵母cDNA文库平板上共长出1300个单克隆,次级酵母cDNA用的文库平板滴度大约为1.04×107cfu/mL。从次级cDNA等文库克隆培养基中随机选择的24个新型克隆经过PCR等检测,凝胶电泳克隆图谱中的条带结果显示24个新型克隆全部经过扩增后均有条带,重组成功率平均为100%且克隆插入每个片段平均时间长度>1 000 bp(图2)。由此可知,以上统计数据已经达到如何构建能在高温环境胁迫下GB-30叶用绿叶莴苣作为酵母双杂交的cDNA文库的标准。

图2 插入片段大小及重组率鉴定Fig.2 Identification of insert fragment size and recombination rate

2.4 cDNA文库质量鉴定

该cDNA酵母文库平板上共产出1 000个核体系克隆子,文库平板滴度平均为1.0×108cells/mL。利用PCR来检测叶用莴苣杆菌cDNA体系酵母化学文库平板重组率与克隆插入每个片段平均长度,在本试验的核体系酵母cDNA文库平板培养基中随机选择24个核体克隆进行检测。根据凝胶电泳克隆图谱仪的检测数据结果显示,24个核体克隆全部经过扩增后均有条带,重组的效率平均为100%,且克隆插入每个片段平均插入长度为> 1 000 bp(图3)。由此可知,以上检测数据已经达到了对构建细胞高温层的胁迫下GB-30叶用莴苣核体系酵母cDNA文库标准。

图3 酵母克隆鉴定Fig.3 Yeast cloning and identification

3 讨论与结论

高质量的cDNA文库是筛选蛋白互作的前提。核体系酵母文库的质量主要是通过文库的库容量判定。对于一个含有104个转录本的物种来说，106库容的cDNA文库是对该物种所有的转录本的100倍覆盖。本试验初级文库的库容量为1.36×107，次级文库的库容量为1.04×107，由此可知本试验构建的核体系酵母文库已达到质量标准。王玉姣, 陈姗姗等构建的cDNA文库库容量为1.13×106[10]；许向阳等人构建的干旱胁迫下‘Micro-Tom’番茄酵母双杂交cDNA文库库容量为3.4×106[11],相比本试验构建的cDNA文库基因信息更全面。cDNA文库质量是否达到标准的另一个鉴定方法是插入片段及重组率。本试验初级、次级文库的插入片段平均长度均>1 000 bp，重组率为100%，是达到文库质量标准要求的。许向阳等构建的文库插入片段平均长度皆为 1 000 bp,重组率是100%[11]，与本试验结果一致；刘露露等构建的文库插入片段平均长度皆为 1 000 bp,重组率是96%[12]。由此可见本试验构建的核体系酵母cDNA文库假阳性更低，质量更符合标准。

核体系酵母文库非常适用于一个诱饵内的基因直接定位保存在一个核细胞系统内的各类蛋白。已知一个诱饵内的基因定位有一些跨细胞膜内的区，也那么可以直接考虑把这些跨细胞膜内的区基因切除以后直接用来找核系统体系酵母文库蛋白筛库[13]。酵母双杂交结合技术目前作为一项较成熟的生物技术，已可用于药物临床试验研究多种抗原单体蛋白质间相互作用,具有同时不断发现新的多种抗原单体蛋白质和其他抗原蛋白质的相互作用功能、在一个抗原细胞体内同时发现研究多种单体抗原和其他多种抗体的相互作用、筛选多种抗原药物的相互作用源和对应位点、建立多个抗原基因分子组织与抗原蛋白质的相互连锁作用光谱结构图等重要技术功能,其应用也会越来越重要[14]。刘爱丽在进行研究一种热激肽肽反应酶与相关分子剪接蛋白因子的互补操作剪接蛋白时通过双杂交剪接技术,从拟南芥cDNA文库中共筛选到了43个单克隆体,通过验证最终确定18个待选基因与目的基因在体外相互作用。而大部分基因在植物体内与目的基因也是相互作用的[15]。

本试验以高温胁迫GB-30叶用莴苣茎尖及叶片混合物为材料，通过Geteway技术构建核体系酵母cDNA文库。结果表明：构建的核体系酵母文库已达质量标准，总克隆数 1.36×107CFU/mL，重组率为 100%，平均插入片段长度>1 000 bp。