实验教学中苯酚硫酸法检测灵芝多糖的探索*

郜玉欣，孙立权，田 虹

(北京理工大学生命学院，北京 100081)

实验教学是本科生教学大纲的重要组成部分。开展实验教学目的就是要培养学生的动手能力、运用书本理论的能力、分析解决问题的能力，养成学生的实事求是的科学态度和认真细致的工作作风和良好的科学素养。实验技能也是为学习后续课程和独立开展科学研究奠定基础，有助于对学生的创新思维、创新意识和创新理念的形成[1-4]。随着科学技术的发展和仪器价格等降低，原来主要用于前沿科学研究实验的大量先进仪器设备也越来越多地用于实验教学。因此，在实验教学改革中，要结合理论教学积极引入科研中的先进方法和设备，让实验教学与理论知识传授、能力培养和素质提高协调发展。 实验设计时，要本着“将经典实验教学内容进行升级改造，引入现代分析技术，加强综合性和研究性训练、促进教与学”的教改思路，来助力“新工科”建设[5-6]。

图1 苯酚-硫酸法反应方程式

多糖提取纯化是生物分离工程教学实验中一个经典内容。植物总多糖的检测可以选择比色法、色谱法[7]和色质谱联用等方法[8]。利用苯酚与被酸水解的单糖显色反应就是比色法检测多糖的原理，反应方程式见图1。分光光度计作为比色法使用的仪器，结构简单，价格低廉，是利用光吸收定律的基本分析仪器。其中样品池的容量通常为4 mL，每个样品的检测都需要 5～10 mL的浓酸(浓度大于70%硫酸)[9]，因此，每次实验中使用浓硫酸的总量很大。而作为高腐蚀性危化品的浓硫酸在使用过程中具有较高的风险，我们希望在实验中尽量减少浓硫酸使用量，就不会产生大量酸性废液，减小废弃物处理的压力。

酶标仪作为生物类实验中基本分析仪器，虽然在光路方向与分光光度计有些不同，但是其工作原理也是遵循光吸收基本定律——朗伯-比尔定律[10]，目前基本型号仪器价格也不高，是在生物实验室中广泛使用的仪器。与普通分光光度计相比，酶标仪使用多孔板作为盛放样品的部件，比普通比色皿需要的样品少，并且可以多个样品(96孔板同时测96个样品)同时检测，增加了检测通量，提高了检测速度。酶标仪具有温度调节的功能，能够对样品进行恒温加热[11]。因此，我们以灵芝多糖为检测对象设计了使用酶标仪检测提取实验中多糖的新实验方案。在方案中可以实现一次测量多个样品(由孔板上孔数量决定)，同时对样品加热，节约实验时间，进而节约苯酚和浓硫酸等试剂，减少酸性废液产生。实验内容也有助于学生熟练使用移液枪和96孔板等生物实验中基本器材，拓展了酶标仪等基本仪器的应用范围，提升了学生独立操作的实验水平，锻炼了综合设计实验和解决问题的能力[12]。

1 实验部分

1.1 试剂与仪器

灵芝多糖(本实验室纯化样品)；无水葡萄糖、苯酚、浓硫酸，均为分析纯试剂，购自伊诺凯科技有限公司。

(ELx808)酶标仪，Bio-rad；(FA2204C)电子天平，上海越平；超声清洗仪，昆山超声；(DHG-9030A)鼓风干燥箱，上海齐欣；真空干燥箱，上海一恒。

1.2 实验方法

1.2.1 实验溶液配制

(1)灵芝多糖溶液的配制

精密称定灵芝多糖样品5.0 mg，置于50ml的容量瓶中，再加蒸馏水定容，配成0.1mg/ml灵芝多糖样品溶液。

(2)苯酚溶液的配制

精密称定重蒸[13]苯酚5.0 g，溶解后倒入100 mL棕色的容量瓶中，再加蒸馏水定容，混匀即得。

(3)葡萄糖标准溶液的配制

精密称定无水葡萄糖标准品5.0 mg，置于50 mL的容量瓶中，再加蒸馏水定容，配成0.1 mg/mL葡萄糖标准品溶液，再分别移取该葡萄糖溶液，配成20、40、60、80和100 μg/mL系列葡萄糖标准溶液。

1.2.2 方法精密度

(1)苯酚-硫酸法线性范围

分别移取标准葡萄糖溶液(20、40、60、80、100 μg/mL)与5%苯酚溶液以及浓硫酸在96孔板中混合，体积比为1:1:5, 总体积为180 μL，在酶标仪上进行震荡，反应温度为25 ℃，显色时间30 min，测定吸光度，酶标仪检测波长设置在490 nm，并使用蒸馏水作为试剂空白。绘制标准曲线，用直线回归方程拟合。

(3)方法稳定性考察

分别移取灵芝多糖溶液于96孔板中，按苯酚-硫酸法显色条件显色，并在酶标仪对其进行时间-吸光度曲线的扫描，考察其稳定性。

1.2.3 单因素试验

采用苯酚-硫酸法，用葡萄糖标准溶液为对象，分别考察以下因素：苯酚用量：标准溶液/苯酚溶液(V/V)(1:1、1:1.25、1:1.5、1:1.75、1:2)；浓硫酸用量：标准溶液/浓硫酸溶液(V/V)(1:4、1:4.25、1:4.5、1:4.75、1:5)；反应时间(20、25、30、35、40 min)；加热温度(60、70、80、90、100 ℃)对吸光度值的影响。

1.2.4 实际多糖含量的测定

取多糖溶液按照单因素确定的最佳条件进行显色反应，在最佳吸收波长处测得吸光度代入葡萄糖标准曲线，计算灵芝多糖含量。

2 结果与讨论

2.1 方法线性范围考察

以葡萄糖质量浓度为横坐标、以吸光度为纵坐标，绘制葡萄糖标准曲线如图3所示，苯酚-硫酸法得出线性回归方程为 y=0.0037x+0.2433 (R2=0.9993)，表明本方法拟合曲线在 0～100 μg/mL范围内具有良好的线性关系。

图2 苯酚-硫酸法的葡萄糖标准曲线

根据图2可知，苯酚-硫酸法标准曲线的线性范围内相关系数R2为0.9993，表明苯酚-硫酸法标准曲线线性拟合度高、准确。

2.2 方法稳定性考察

采用苯酚硫酸法检测灵芝多糖溶液和葡萄糖标准溶液，用酶标仪进行动力学监测，30min内每间隔2 min进行一次检测，结果如图3所示。从图3中可看出苯酚-硫酸法测得的吸光度稳定。

图3 苯酚-硫酸法的稳定性

2.3 苯酚-硫酸法中单因素试验参数优化

2.3.1 苯酚溶液用量的影响

由图4可知，葡萄糖标准溶液/苯酚溶液(V/V) 为1:1.5时吸光度值最大，而其他苯酚用量的吸光度均比葡萄糖标准溶液/苯酚溶液(V/V) 为1:1.5时的吸光度小，故合适的待测溶液/苯酚溶液(V/V) 为1:1.5。

图4 苯酚-硫酸法中不同苯酚溶液量对吸光度的影响

2.3.2 浓硫酸用量的影响

由图5可知，葡萄糖标准溶液/浓硫酸(V/V) 为1:4.5时吸光度值最大，而其他浓硫酸用量的吸光度均比葡萄糖标准溶液/浓硫酸(V/V) 为1:4.5时的吸光度小，故合适的待测溶液/浓硫酸(V/V)为1:4.5。

图5 苯酚-硫酸法中不同浓硫酸量对吸光度的影响

2.3.3 显色反应时间的影响

由图6可知，在加热时间低于30 min时，吸光度略低，可能是显色反应不够完全；达到30 min时，吸光度最大，而超过30 min时，随着时间的增加，吸光度逐渐降低，因此显色反应时间应选择30 min左右，故合适的苯酚-硫酸法显色反应时间为30 min。

图6 苯酚-硫酸法中不同反应时间对吸光度的影响

2.4 方法的可行性

上述单因素实验给出了苯酚-硫酸法能较好地应用于酶标仪检测多糖。虽然苯酚-硫酸法由于需要配制苯酚溶液和浓硫酸，并需要较长的显色时间，比报道的蒽酮-硫酸法[14]所需要的时间稍长，但是苯酚-硫酸法显色所需要的温度远低于蒽酮-硫酸法，因此在实际实验教学过程中，指导教师选择苯酚-硫酸法方法用于教学实验内容。

3 新方法的实际检测应用

在《生物分离工程实验》课程中，我们应用了新的苯酚-硫酸法检测灵芝多糖含量，通过与分光光度法对比(对比结果见表1)，得出了用酶标仪检测多糖的优点：

表1 不同仪器苯酚-硫酸法检测多糖比较

(1)采用酶标仪检测多糖，在一个教学班次(分组10组)中所用浓硫酸的量由900 mL减少到50 mL，所用灵芝多糖样品、葡萄糖、苯酚的试剂量也减少了近90%；

(2)检测时间由每组需要近一个小时，缩短到每个实验班次35分钟，减少了近三分之二的实验教学时间，给其他实验内容(比如实验结果分析)提供了较充裕的教学时间；

(3)减少了酸性实验废液，使用酶标仪时只产生使用分光光度计时的废液的5%。

在实验教学中发现新检测方法会提高学生移液枪和多孔板的使用熟练程度，深入了解酶标仪的原理和结构，降低了使用浓硫酸的安全风险。本次教学改革内容是一个将仪器设备由科研使用转入实验教学使用的有力示范，对培养学生的创新思维、创新意识，强化学生多渠道解决实际问题的能力将发挥重要作用，有助于实现“新工科”人才的培养目标[15]。