等离激元增强荧光的纳米结构、机制及其应用*

钟 婷，鄢 强，卢 茜，王 盼，孙丰云，陈佳琪，2

(1 成都大学 机械工程学院，四川 成都 610106；2 四川省粉末冶金工程技术研究中心，四川 成都 610106)

荧光是指荧光物质的基态电子受到某种特定波长的激发光照射时跃迁到激发态，在回到基态过程中释放光子的现象。相比之下，PNP在单色电磁辐射激发下显示出极弱的光致发光，然而等离激元纳米结构的光学消光(吸收+散射)截面比分子荧光物质的光学消光截面高几个数量级[1]。原因是等离激元纳米结构产生的局域表面等离激元共振效应[2]，使得等离激元的消光截面显著增强。等离激元增强的荧光光谱是一种非常出色的光学检测手段，具有超高灵敏度，荧光物质与等离激元的共振耦合可以大大提高发射强度、角分布、辐射偏振以及辐射衰减速度[3]。通过对等离激元纳米材料的优化，荧光增强因子(EF)最多可以提高三个数量级，EF>103[4]。

最近几年，等离激元荧光增强的实验和理论研究取得了爆炸性的进展，并且也有了一系列新的发展和应用。例如，等离激元纳米结构的荧光增强提高了单分子荧光和成像分辨率的灵敏度[5]，并将单分子检测研究扩展到弱发射物的检测。等离激元增强荧光的纳米材料因在提高相应器件或工艺的性能以及在光学性能方面展现出独特优势，被广泛应用于生物传感器[6]、生物成像[7]、生物医学诊断[8]等生物医学方面，对光热治疗、光学治疗和生物成像多功能一体化具有重要意义，同时等离激元荧光增强技术在催化剂、太阳能电池和新能源等领域都具有重要的促进作用。本文综述了等离激元荧光增强机制、构效关系及其在生物方面的应用，并对各领域可能存在的潜在应用进行了展望。

1 等离激元增强荧光的机制

在光谱学中，最常见的荧光物质是有机染料分子，其特征是具有芳香环或共轭碳链。荧光物质受到特定的激发光照射并吸收高能光辐射后，导致内部电子能级跃迁，由现处于的轨道跃迁到能量更高的轨道，通常是从基态激发到激发态，由于激发态不够稳定，因此会以特定的跃迁方式返回到基态，并重新释放低能长波光，即产生荧光。然而分子荧光的消光系数较低且其光稳定性差，在激发之后，可能会参与某些化学反应，导致分子荧光存在几乎不可逆转的损失，而降低激发功率会产生较弱的荧光发射，限制光漂白效应，从而延迟信号衰减。PNP表面的自由电子在外部电磁场的驱动下，偏离原子核产生一种光激发的集体震荡，被称为局域等离激元共振(LSPR)。由于PNP具有优异的LSPR性质，其附近的电磁场可得到极大增强，在纳米尺度上具有指数级的空间变化。等离激元增强荧光现象出现在荧光物质靠近PNP时，荧光物质的发光强度较其自由状态下明显增强。通过等离激元增强荧光的新颖方法，可对荧光信号进行放大，同时增加荧光物质的亮度及其光稳定性。因此，等离激元增强荧光的原理是(如图1所示)，LSPR导致的局域电磁场增强效应可有效地改变荧光物质所处的介电环境，从而对荧光物质的激发和发射过程进行调制，通过提高其激发和辐射效率以达到荧光增强的目的。影响LSPR的因素通常包括PNP的元素组成、形状、尺寸、颗粒间距和环境介质等。因此，通过研究PNP本身的特征(如纳米核的材料、形状和尺寸等)，荧光物质与纳米核的距离，以及LSPR与荧光物质吸收和发射光谱的重叠程度对荧光增强的影响，可优化等离激元纳米结构以达到最佳的荧光增强效果。

图1 等离激元纳米结构增强荧光过程示意图

2 PEFNSs的构效关系

随着纳米颗粒合成的发展，具有不同形貌的PNP被设计并用作等离激元荧光增强的纳米核，从而增强了其附近染料分子的荧光强度。PEFNSs由PNP核心以及表面包覆的壳层组成，核与壳通过物理或化学作用相互连接。通常地，在具有某种形貌特征的PNP表面包覆介孔材料(如介孔二氧化硅，SiO2)，得到PNP@SiO2的核壳纳米结构。包覆介孔壳的PNP又通过化学和物理吸附等方式促进荧光染料吸附到其表面，形成PNP@SiO2+Dye纳米结构(如图2所示)。研究表明，此类核壳纳米结构的等离激元荧光增强效应受纳米颗粒的组份、尺寸、形状和荧光物质与PNP之间的间隔距离、荧光物质与等离激元吸收带之间的光谱重叠程度的影响。

图2 染料与等离激元核壳纳米颗粒结合的方案

2.1 等离激元纳米核材料、形状和尺寸对荧光增强的影响

PNP的材料、形状和尺寸对等离激元荧光增强有很大的影响，通过优化PNP的特征可以使EF得到极大地提升。等离激元纳米材料种类的选择主要取决于PNP的LSPR峰位调节能力、消光强度以及化学稳定等特性，如金、银纳米颗粒的LSPR峰位从可见到红外区丰富可调，通常可用于增强可见-近红外光区的荧光。金纳米颗粒具有良好的稳定性、化学惰性和生物相容性，且易与生物分子相互作用。而银纳米颗粒具有狭窄的共振吸收带和较高的散射效率，获得的荧光强度增强倍数较金纳米颗粒略强。Sorenson等[9]在金膜上面沉积银纳米胶体，发现与单一的银纳米胶体相比，平均增强了50倍，Luchowski等[10]在半透明的银膜上组装银纳米胶体，获得了进一步提升，平均增强了70倍。

此外，采用种子介导的方法可以准确地调控金纳米颗粒的大小和形状[11]，可在溶液中生长出不同尺寸的金纳米球(GNSs)、金纳米棒(GNRs)、金纳米棱镜(GNPRs)等。通过对PNP形状的调控可以对LSPR峰强和峰位特性进行调制，从而影响其荧光增强效应。李志远等[12]通过比较具有相同壳层的GNRs和GNSs研究了形状对荧光增强的影响。发现与GNSs相比，GNRs尖端的电磁场更大，同时GNRs的双等离激元共振同时对荧光的激发和发射过程具有增强效果(见图2(a)、(b))。欧阳金等[13]研制了一种新的基于GNPR的荧光探针——GNPR@SiO2@二氢卟吩Ce6(Ce6)，通过与对照组GNR@SiO2@Ce6进行等离激元增强荧光比较，结果发现，GNR@SiO2@Ce6的荧光增强倍数小于GNPR@SiO2@Ce6，说明GNPR比GNR具有更好的等离激元增强荧光效果。

最后，通过改变PNP的尺寸也可得到优化的荧光增强效果。Li的团队[14]制备了尺寸在50～300 nm之间的银纳米颗粒，其可见吸收峰随着纳米颗粒尺寸的增大而红移，表明银纳米颗粒的表面等离激元共振特性也随尺寸可调。Aroca组[15]通过改变金纳米颗粒的大小，发现与核尺寸为4 nm的小金纳米颗粒(EF≈25)相比，核尺寸为100 nm的大金纳米颗粒产生更高的EF(约60)。

2.2 等离激元纳米核与荧光物质间距对荧光增强的影响

在PEFNSs中，EF和等离激元纳米核与荧光物质间的距离密切相关。高媛媛组[16]制备了不同厚度(分为7 nm、12 nm、18 nm、20 nm和24 nm)的GNR@SiO2，且采用静电吸附方法与碳量子点结合，并测定荧光光谱如图2(c)所示，不同壳层厚度的GNR@SiO2对碳量子点的荧光增强倍数分别为8.9、10.8、17、25.3和15.9倍。杜学忠组[17]在研究Ag@SiO2纳米结构时，发现由于无定形SiO2中光程的增加和激光焦点与银核的偏离，当Ag@SiO2纳米颗粒的厚度为9 nm时，荧光强度最高。此外，朱一华等[18]通过调节Ag@SiO2纳米结构的壳层厚度控制银纳米颗粒与碳量子点之间的距离，发现当银纳米颗粒与碳量子点的距离是(10±2) nm时，碳量子点的荧光发生猝灭现象；而当距离为(20±2) nm时，碳量子点荧光强度增大了4倍；并且发现间距变为(30±2) nm时，荧光强度开始下降。与此同时，Jérémie等[19]通过改变Ag@SiO2纳米材料与荧光素5(6)-异硫氰酸酯的距离，从而获得了该核壳纳米颗粒的荧光衰减曲线[19]。其结果显示当荧光物质位于离PNP表面10～15 nm之间观察到荧光的最大增强，而在离核心5 nm或更小的地方猝灭现象占优势。研究均表明，通过改变PNP-荧光物质的距离，等离激元增强荧光的核壳纳米结构的EF随介孔壳厚度的增加呈现先增加后降低的趋势。通常当距离在10～20 nm时，增强能力最强[20]。这是因为当荧光物质与PNP的距离相近时，由于非辐射能量转移到PNP，导致荧光发生明显猝灭[21]。随着荧光物质逐渐远离等离激元纳米核心，阻止了荧光猝灭的发生，PNP表面的荧光物质逐渐由荧光猝灭状态变为荧光增强状态。随着其厚度进一步增加，PNP的局域电磁场传递到荧光分子的机率减少，从而导致整个体系的荧光强度的衰减。因此，在等离激元增强荧光的核壳纳米结构体系中，可通过调整PNP与荧光物质间距以达到最佳的荧光增强效果。

2.3 荧光物质种类对荧光增强的影响

影响荧光增强的因素除了等离激元纳米结构本身以外，其加入的荧光物质种类也会对荧光增强因子和量子产率造成影响。Gartia等[22]研究了五种不同荧光染料在直径为80 nm的银纳米衬底表面的荧光增强因子和量子产率。选择了五种不同量子产率范围和不同激发波长范围的染料，分别为罗丹明6G(R6G， λex=532 nm)、荧光黄(λex=440 nm)、吖啶橙(λex=440 nm)、罗丹明-B(Rh-B，λex=532 nm)、曙红-Y(λex=532 nm)。结果发现，与玻璃表面相比，等离激元Ag纳米衬底上的R6G、荧光黄、吖啶橙、罗丹明-B和曙红-Y的荧光分别增强了20.5、100、8.34、5.13和4.3倍，并且五种荧光染料在PNP表面的量子产率分别为99%、99%、75%、86%和85%。此外，通过量子产率和荧光寿命测试，发现所有染料的辐射衰变率和非辐射衰变率之比都大于1。等离激元纳米结构荧光增强还依赖于荧光物质种类的激发、发射光谱与纳米颗粒的LSPR峰位的匹配程度。Asselin等[23]分别将Ag@SiO2与不同的荧光物质(荧光黄、曙红和Rh-B)作用，发现等离激元带(460 nm左右)与荧光物质种类激发带的重叠明显相关：5 nm间隔物的EF值从10.9(异硫氰酸荧光素，FiTC)降低到4.9(曙红异硫氰酸酯，EiTC)到3.5(罗丹明B异硫氰酸酯，RBiTC)(如图2d所示)。同时该实验也表明对于具有足够重叠的所有荧光物质种类，最大EF的最佳距离是相同的。由此可得出，荧光增强高度依赖于荧光物质激发-发射能级与等离激元共振带的重叠程度，匹配程度越高，荧光增强的作用就越明显。

图3 等离激元增强荧光的纳米结构的构效关系

3 应 用

PEFNSs具有优异可控的光学性质，较强的生物相容性和表面可修饰性等优点，对在生物医学领域的广泛应用具有重要意义。利用等离激元纳米结构表面荧光探针增强的荧光信号，可实现生物物质的灵敏检测；PNP可实现多功能和靶向修饰，与荧光物质结合在生物成像方面也有良好的应用；因PEFNSs与上转换发光材料结合，激发光具有较强的组织穿透力和较低的辐射损伤，故在肿瘤的光学疗法中也得到了非常重要的应用。此外，PEFNSs在催化、生物监测和化学物质检测等方面也有一定的应用前景。

图4 等离激元增强荧光的纳米材料在生物传感器[24],生物成像[7],肿瘤治疗[25],催化剂[26]等方面的应用

3.1 生物医学应用

3.1.1 生物传感器

生物传感器是检测低浓度生物标志物的一种途径[24]。荧光生物传感器是最受欢迎的生物传感技术之一，通过将等离激元纳米结构和荧光物质放置在非常接近的位置，可以显著增强生物荧光物质信号强度。Kim小组[25]使用新型的水凝胶微阵列制造了一种基于酶的荧光生物传感器用来检测对氧磷(一种著名的神经毒性有机磷化合物)，该微阵列使用了带有量子点的 Ag@SiO2核壳纳米结构，利用等离激元增强的荧光来放大荧光信号。通过调节SiO2的厚度优化了Ag@SiO2的荧光增强效果，其荧光强度比没有量子点的核壳纳米结构提高了5倍，检测限约为0.1 nM。2014年，Wang等[26]制备的Ag@SiO2-DNA-Cy3纳米生物传感平台，被应用于金属离子和有机小分子检测。这项工作中，DNA杂交是在目标分子存在地情况下进行的，通过与DNA单链杂化将Cy3荧光物质带到纳米结构表面，Cy3的荧光强度可以通过Ag纳米颗粒表面的LSPR来增强。这种生物传感器为Hg2+的检测提供了高灵敏度和选择性，检测限值为1.4 nM，该生物传感器可被开发用于其他金属离子和有机分子分析。大多等离激元增强荧光生物传感器的工作都集中在平面结构附近的荧光物质上，而基于溶液的灵敏生物传感器的研究非常有限。2014年，庞元峰等[27]使用Ag@SiO2纳米颗粒灵敏地检测H5N1流感病毒地重组血凝素蛋白(rHA)。将抗rHA适配子固定在PNPs的表面，并使用噻唑橙荧光标记作为等离激元增强荧光平台，这一检测过程只需要30 min，检测限为 2 ng·mL-1。等离激元增强荧光的纳米材料提高了检测灵敏度并缩短了分析时间，在生物传感器设计中具有极大的应用潜力。

3.1.2 生物成像

生物成像技术通过应用“成像”技术来促进疾病的诊断、治疗和预防，在改善人类健康方面发挥了至关重要的作用[28]。陈海燕等[29]通过金纳米簇(GNC)与肿瘤组织表面高表达αvβ3整合素的环状RGD(cRGD)和对核蛋白具有高亲和力的适体AS1411(Apt)结合，初步建立了具有双重靶向功能的新型纳米平台，即GNC-cRGD-Apt，用近红外荧光染料(MPA)进一步功能化GNC-cRGD-Apt，得到近红外荧光双靶向探针GNC-MPA-cRGD-Apt。通过直接观察GNC-MPA-cRGD-Apt在肿瘤小鼠模型中的生物分布准确确定肿瘤部位，且GNC-MPA-cRGD-Apt是通过肾-膀胱排泄系统排出。为了验证GNC-MPA-cRGD-Apt探针的体力内结果，分别在1 h、4 h、8 h和24 h处死小鼠，收集主要脏器并进行成像，实验结果表明，肾脏各时间点均出现较强的荧光信号，注射后24 h，除肾脏出现中度荧光信号外，其余主要组织的荧光均消失。体外显像结果与体内显像结果一致，其中荧光在注射后6 h出现，在注射后8 h完全消失。为了进一步证实GNC-MPA-cRGD-Apt的肿瘤靶向性，用激光共聚焦显微镜观察了探针的体外肿瘤分布，结果发现在肿瘤的表面和深处都观察到了更强的绿色荧光。以上实验结果在体内外均表现出低的细胞毒性和良好的肿瘤靶向能力，表明其在肿瘤成像方面的临床潜力。杨飘萍等[30]利用GNR@GdOF：Yb3+，Er3+上转换纳米棒(UCNRs)来检测其体内红外热成像效应，在注射了100 μL生理盐水、GNRs(1 mg/mL)和UCNRs (1 mg/mL)后，用980 nm激光照射荷瘤小鼠，发现UCNRs组温度随时间增加而升高(从36.0 ℃升至50.9 ℃)，明显高于生理盐水组和GNRs组，具有良好的体外光热成像。以等离激元为介导的荧光为纳米尺度的成像提供了先进的场景，并正在成为生物科学中的主要光谱工具。

3.1.3 光热、光动力治疗(增强上转发光)

近年来利用纳米材料进行光热治疗(PTT)、光动力疗法(PDT)得到了医学领域研究人员的青睐。众所周知，PTT是一种具有高特异性的癌症治疗方式，在980 nm激发光照射下，利用光热转换产生的高热量在不损害其它正常组织的情况下，实现病变细胞的靶向治疗[31]。陈晓兰等[19]开发了一种掺杂了荧光染料RBiTC和细胞穿透肽(R8)的新型多功能二氧化硅纳米结构——Pd@Ag@SiO2(RBiTC)-R8，该纳米结构可增强细胞对纳米颗粒的摄取，进一步提高PTT治疗效率。实验通过进行标准MTT比色法测定来评估Pd@Ag@SiO2(RBiTC)-R8的潜在细胞毒性，从24 h后得到的测量平均值看出，在0～ 300 g·mL-1浓度范围内，细胞存活率估计在80%以上，其低细胞毒性显示了该纳米结构在PTT中的应用潜力。

PDT是利用光激发光敏剂产生活性氧进行癌症治疗的方法。传统的有机PDT光敏剂(例如：Ce6和ZnPc)存在着易光漂白、稳定性差以及体内循环快的问题，而PDT因其优异的选择性，良好的适用性，操作流程简单以及可反复多次治疗等优点，被广泛应用于癌症的治疗。黄文泽等[32]设计了一种用于治疗新型癌症的治疗剂，由上转换纳米颗粒(UCNP)和介孔二氧化硅包覆的GNRs与光敏剂部分花青540(MC540)组成的杂化纳米系统，UCNP和GNR之间的高光密态可以诱导等离激元增强，从而改善PTT和PDT。治疗剂是包埋在纳米气泡(NB)内的GNR@UCNP偶联物(GNR@UCNP@NB)，808 nm的近红外光从UCNP传递到GNR，从而赋予GNR高温等离激元效应，此外MC540光敏剂产生活性氧(ROS)，从而激活癌细胞的凋亡途径。用JC-1染料作为线粒体膜电位的指示剂，以确定细胞死亡的机制，体内外分析结果证实了改良双光疗的疗效明显增强。由此可见，将等离激元纳米材料与UCNPs结合更易到达肿瘤部位，且有效提高光敏剂局部浓度的新材料和创新方法可提升PTT与PDT在肿瘤治疗中的效用，对肿瘤增强的PTT和PDT多功能一体化具有重要的意义。

4 结 语

(1)等离激元纳米材料在某一特定频率的激发光照射下，表面的传导电子发生集体振荡而产生局域的表面等离激元共振。局域等离激元共振导致的局域电磁场增强效应可有效地改变荧光物质所处的介电环境，从而对荧光物质的激发和发射过程进行调制，通过提高其激发和辐射效率达到荧光增强的目的。

(2)纳米颗粒的组成、尺寸、形状、核壳间隔层厚度以及荧光物质和等离激元吸收带之间的光谱重叠程度等方面都在一定程度上对荧光增强产生影响。PNP荧光增强随核心尺寸的增加而增加，在一定范围内，达到最大荧光增强；PNP荧光增强强度随等离激元纳米材料和荧光物质间距先增加后降低；当荧光物质的发射、吸收光谱与等离激元带的光谱的重叠程度越大时，荧光增强的效果就越明显。通过对PEFNSs进行调整和优化，可达到最佳荧光增强效果，从而实现特定功能下的应用。

(3)由于具有独特的光学性质，等离激元增强荧光的纳米材料被广泛应用于生物医学领域，在生物传感器、生物检测、生物成像、医疗诊断等方面都存在巨大的应用潜力。此外，PEFNSs正在渗透到生物、化学和物理甚至工业、制造业等更多的领域。