恶性胸水细胞蜡块在肺癌诊断及治疗中的应用研究

郭业兵，王木森，高菲

（东阿县人民医院，山东 聊城 252200）

浆膜腔积液是恶性肿瘤（尤其是恶性间皮瘤、淋巴造血系统肿瘤）常见的临床症状[1]。近年来，浆膜腔积液细胞学涂片结合免疫细胞化学、细胞蜡块结合免疫组织化学已在临床中广泛应用于判断病变性质、鉴别肿瘤来源及应用于肿瘤的分期、分级。大多数恶性肿瘤可发生胸水转移，与肺转移或胸膜侵犯有关，尤其以肺癌、乳腺癌、胃癌、结肠癌最为常见。据报道恶性胸水中大约48.6%是由肺癌引起[2]，肺癌患者约17%首诊时伴有胸水[3]，而一旦出现胸水往往提示病情已处于晚期，绝大部分已失去手术机会。目前，EGFR/ALK/ROS1靶基因状态及PD-L1的表达情况已成为晚期肺癌个体化治疗及评估预后的重要参考指标。本研究对恶性胸水细胞蜡块行免疫组化检测进行组织学分型，并对确诊的肺腺癌的细胞蜡块检测EGFR/ROS1/ALK等靶基因状态及检测PD-L1表达状态，评估在临床靶向治疗、免疫治疗的应用前景及价值。

1 材料与方法

1.1 材料 搜集2014年4月—2021年8月山东第一医科大学附属东阿医院存档的胸水细胞蜡块429例，其中男272例，女157例，男女比例为1.73：1.0，年龄41～91岁。该研究获得医院伦理委员会批准。

1.2 方法

1.2.1 细胞蜡块的制备 胸水标本离体后尽快送至病理科（最长不超过2 h）,静置15～30 min后，取底部液体50～100 mL，3000 r/min离心5 min，提取沉淀物进行细胞学涂片，然后弃净上清液，加入3.7%中性缓冲福尔马林固定15 min，再2500～3000 r/min离心2 min，将沉降物转移到专用滤纸上，最后常规脱水、透明、浸蜡，石蜡包埋、制片，HE染色。

1.2.2 免疫组织化学 免疫组化在Roche BenchMarK GX 全自动免疫组化机上进行，选取CK7、CK20、Villin、TTF-1、NapsinA、CDX2、p40、P63、GATA3、GFDP-15、PAX-8、WT-1、CR、D2-40、CD68、ER、PR、CK19、PDL1等不同的抗体组合进行免疫组化检测。VENTANA PD-L1（SP263）asssy购自罗氏公司，其余抗体购自福建迈新生物技术有限公司，均常规设置阴、阳性对照。

1.2.3 细胞蜡块DNA、RNA的提取 对于部分确诊肺腺癌患者的细胞蜡块，常规脱蜡，提取脱氧核糖核酸或核糖核酸用于基因检测。使用厦门艾德核酸提取试剂盒提取核酸，美国Q5000超微量分光光度计测定DNA、RNA浓度及OD260/280比值。

1.2.4 EGFR、ROS1、ALK基因检测 融合类检测通过在融合位点两侧设计特异性引物和探针，并结合一步法RT-PCR方法对样本中ALK和ROS1融合基因进行检测。突变类检测是通过ADx-ARMS技术检测样本DNA中的EGFR基因。共检测25个突变位点和21种融合类型。试剂盒购自厦门艾德生物医药科技有限公司。EGFR、ROS1、ALK基因检测均在ABI 7500实时荧光PCR仪（美国赛默飞公司）中进行扩增。

2 结果

2.1 肿瘤组织学类型 429例胸水细胞蜡块中恶性胸水138例，常规富集细胞、甲醛固定、脱水、透明，石蜡包埋、HE染色，镜下观察细胞形态及结构保持完好（图1、图2）。结合138例恶性胸水患者的病史及细胞学涂片，选取不同的抗体组合，进行组织学分型。对于不明来源的腺癌，常规采用TTF-1（图3）、NapsinA、CK7、CK20、Villin进行初筛，酌情联合应用CDX2、GATA-3、PAX-8、CA125、WT-1、GCDFP-15、Tg、P504S、PSA等对大部分腺癌能做到准确组织学分型。CD56、CgA、SyN、KI-67组合能鉴别出小细胞癌。P40、p63、CK5/6、CK19、p16能筛出鳞癌，但原发部位要结合临床。138例病例的组织学类型：肺腺癌97例，小细胞癌10例，鳞状细胞癌3例，乳腺癌6例，胃癌5例，卵巢癌3例，子宫浆液性癌1例，子宫癌肉瘤1例，骨髓瘤1例，胆管癌1例，未知来源10例。

图1 血性背景中癌细胞呈腺样、乳头状分布（×20）

图2 癌细胞乳头状排列，异型显著（×40）

图3 EnVision法显示癌细胞弥漫核表达TTF-1（×20）

2.2 基因检测结果 对确诊的84例肺腺癌行ARMS荧光PCR检测，其中57例检测到突变基因：53例EGFR突变（突变率63.1%）、1例ROS1融合突变（突变率1.19%）、3例ALK融合突变（突变率3.57%）。具体突变类型：EGFR 20号外显子插入突变3例（见图4），T790M突变1例，19del突变16例，L858R 突变32例，G719X突变1例，其中有2例双突变（G719X+ S768 I和 L858R+T790M ）。ROS1 融 合 (SLC34A2-ROS1/CD74-ROS1/EZR-ROS1) 1例，ALK融 合（EML4-ALK）3例。阴性 27例。PDL1 共检测5例，阳性表达率 40%（2/5例），1例TC值 40%，1例 TC 值5%。

图4 ARMS-PCR检测： EGFR突变阳性扩增

3 讨论

临床发现当患者出现恶性胸水时，大多提示已处于肿瘤晚期，常常无法通过手术获取组织标本，不能明确病理诊断，导致后续的治疗难以继续。脱落细胞学是胸水检查的一种临床应用多年的成熟技术，具有方便、快捷、经济、可重复检查等优点，但受细胞数量、制片技术及背景干扰等影响，通常影响诊断及后续检测，难以满足临床的需求。

近年来胸水沉渣包埋并结合免疫组化在临床中得到广泛的应用，不仅能更好的富集细胞并且可以多次取材，细胞沉淀过程中能保持良好的形态和结构，常规染色细胞无皱缩及变性，可进行免疫组化标记，结合细胞涂片及临床信息确定肿瘤来源及组织学分型。本研究对138例恶性胸水患者，结合病史及细胞学涂片，选取不同的抗体组合，进行组织学分型，大多数都能获得准确的组织学类型。当然，免疫组化也是有局限性的，本组病例中仍有10例未能明确来源。

多年来肺癌一直居肿瘤死亡率的首位。其靶向药的研发及上市一直是所有癌种中最多、最快的。2021年《第5版非小细胞肺癌NCCN指南》推荐肺癌患者应监测包括EGFR/ROS1/ALK/PD-L1在内的十大靶点。目前FDA批准的用于非小细胞肺癌的靶向和免疫药物共有29款，尤其在2021年5月21号FDA批准Rybrevant（代号JNJ6372）应用于EGFR 20号外显子插入突变的肺腺癌，是对这部分患者研发的首款靶向疗法，具有里程碑式的意义。肺癌中80%～85%的肺癌为非小细胞肺癌（NSCLC），其EGFR基因的突变率为10%～35%，ALK、ROS1融合发生率分别为3%～7%、2%[4]。EGFR突变状态可以指导EGFR-TKI的用药。而ALK和ROS1基因融合突变患者也可从ALK/ROS1抑制剂中明显获益。近几年肿瘤免疫治疗发展迅猛，PD-L1、微卫星不稳定（MSI）、肿瘤突变负荷（TMB）等指标对治疗反应具有较高的预测意义，尤其PD-L1是目前免疫治疗应用最广泛的标志物[5-6]。目前国内已有批准多种PD-1/PD-L1抑制剂用于一、二线或以上治疗[7]，PD-L1免疫组化检测可作为指导晚期非小细胞肺癌患者接受帕博利珠单抗单药或联合治疗的伴随诊断。《2019版中国临床肿瘤学会（CSCO）原发性肺癌诊疗指南》和《中国非小细胞肺癌免疫检查点抑制剂治疗专家共识（2019版）》一致推荐将EGFR、ROS1、ALK等基因检测与PD-L1检测列入同等重要地位。目前多项文献报道证实，与组织学样本相比较，用细胞蜡块检测肿瘤细胞 PD-L1表达，结果具有很高的一致性[8-11]，可以作为无法取得组织学标本患者的很好的替代品。在实际临床工作中很多晚期患者，由于体质差、肿瘤分期晚，丧失了手术机会，甚至不能耐受支气管镜和穿刺活检，无法获取满意的病理标本，阻碍了下一步治疗。而胸水细胞蜡块可以很好的填补这一空白。EGFR与文献报道数据有差距，其原因可能与样本量较少和异质性有关。PD-L1 共检测5例，1例TC值40%，1例TC值5%,可作为免疫治疗的辅助诊断加以参考。

胸水细胞蜡块在实际操作中也存在一些缺点，临床如果能通过手术切除、CT引导下穿刺等手段获取组织学标本，则优先采用组织学样本进行检测，但对于大部分难以获取组织学标本或不能耐受手术的晚期患者来说，细胞蜡块是一种可靠有效的替代方案，值得在临床工作中推广。