丹酚酸B通过抑制MAPKs/NF-κB 信号通路减轻动脉粥样硬化模型小鼠肝脏炎症反应

张一凡，韩向晖，刘 萍

(上海中医药大学1.附属龙华医院、2.中医外科研究所，上海 200032)

动脉粥样硬化(atherosclerosis，AS)作为心血管疾病的共同病理基础，是脂质在大、中型动脉内膜沉积并导致动脉粥样硬化斑块形成的过程[1]。研究[2]发现，AS是由脂质驱动炎症反应的病理过程。因此，改善脂质代谢、缓解炎症反应仍然是治疗AS的有效方法。而肝脏在脂质代谢及炎症反应中发挥重要作用[3]。因此，本实验拟观察AS模型小鼠的肝脏炎症变化。

丹酚酸B(salvianolic acid B，Sal B)是丹参的主要有效水溶性成分，具有抗炎、抗氧化、抗肿瘤等药理作用，对心血管、肝脏、脑、肺、肾均有保护作用[4]。已有研究发现，Sal B可有效改善肝损伤、抑制肝脏炎症[5]。但是，Sal B在AS模型小鼠肝脏炎症反应中的具体机制尚不完善。因此，本研究以高脂饮食诱导低密度脂蛋白受体(low-density lipoprotein receptor，LDLR)敲除小鼠作为AS模型，观察Sal B对AS模型小鼠肝脏组织炎症因子及其蛋白表达的影响，并探讨其对丝裂原活化蛋白激酶(mitogen activated protein kinases，MAPK)/核因子κB(nuclear factor-κB，NF-κB)等炎症相关信号通路蛋白的调控，明确Sal B对炎症反应的作用及其机制，为其抗动脉粥样硬化临床应用提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1动物 ♂ LDLR基因敲除小鼠，6周龄，体质量为(18～23) g，购于江苏集萃药康生物科技有限公司，动物合格证号：202000150，许可证号：SCXK(苏)2018-0008；饲养于上海中医药大学附属龙华医院SPF级动物实验室。

1.1.2实验药物与试剂 Sal B购于成都普菲德生物技术有限公司，批号19031101，纯度98%。阿托伐他汀钙片(atorvastatin calcium tablets，ATO)，购自上海中医药大学附属龙华医院西药房，批号CK2270。蛋白质抽提试剂盒(批号P0013B)、BCA蛋白定量试剂盒(批号P0010)、SDS-PAGE电泳试剂(批号103019200702)、苏木精-伊红染液(批号052020200176)购自碧云天科技有限公司；油红O染液(批号SLBH0251V)购于美国SIGMA公司；ERK1/2(批号28)、p-ERK1/2(批号28)、p38(批号9)、p-p38(批号13)、GAPDH(批号7)抗体购于CST公司；JNK(批号A1221)、P-JNK(批号A2621)、p-NF-κB(批号C0221)、NF-κB(批号K2320)、p-IκB(批号C1021)、IκB(批号B1621)抗体购于Santa Cruz公司；VCAM(批号GR257919-8)、iNOS(批号GR3205303-1)抗体购于Abcam公司；mRNA提取试剂盒购于中国上海海方生物技术有限公司，批号B4DP210121；PCR反转录试剂盒和 PCR反应试剂盒购于日本TaKaRa公司，批号AJ10935A、AIF1686A；引物由上海闪晶分子生物科技有限公司合成，批号111359735；ELISA试剂盒购于上海西唐生物科技有限公司，批号2009101、2008251、2008261。

Tab 1 NAS histology scoring criteria

1.1.3仪器 垂直电泳仪、置胶架、电泳槽、转膜槽、凝胶成像仪，美国BIO-RAD公司；高速冷冻离心机，德国Eppendorf公司；StepOne Plus实时荧光定量PCR仪，美国ABI公司；SynergyH4 型酶标仪，美国BioTek公司。

1.2 实验方法

1.2.1小鼠干预与造模 LDLR-/-小鼠32只随机分为对照组(CON)、模型组(MOD)、丹酚酸B组(Sal B)、阿托伐他汀组(ATO)，每组8只。CON给予普通饲料喂养，MOD、Sal B、ATO组给予高脂饲料(含脂肪21%，胆固醇0.15%)。12周后，分别给予CON、MOD组生理盐水200 μL腹腔注射，Sal B组给予25 mg·kg-1Sal B溶液腹腔注射，ATO组给予阿托伐他汀1.3 mg·kg-1灌胃，疗程12周。

1.2.2血清生化检测 小鼠腹腔麻醉后，取腹主动脉血，静置0.5 h后，离心，3 000 r·min-1，4 ℃，取上清。血清送上海中医药大学附属龙华医院检验科，应用全自动生化仪检测总胆固醇(total cholesterol，TC)、甘油三酯(triglyceride，TG)、丙氨酸氨基转移酶(alanine aminotransferase，ALT)、天冬氨酸氨基转移酶(alanine aminotransferase，AST)。

1.2.3小鼠主动脉、肝组织病理染色 小鼠主动脉、肝组织在4%中性甲醛溶液中固定48 h。主动脉移至蔗糖溶液中脱水，OCT胶包埋，切片厚度约10 μm，按照油红O标准流程进行染色封片晾干后在显微镜下观察并拍照。采用Image Pro Plus图像分析软件测量斑块及官腔面积，比例(%)=斑块面积/管腔面积×100%。肝组织脱水浸蜡后，进行石蜡包埋切片，厚度约10 μm，按照HE标准流程进行染色封片晾干后在显微镜下观察并拍照。肝组织常规评分标准见Tab 1。

1.2.4ELISA检测小鼠血清炎症因子含量 取小鼠血清。配制标准品液、洗涤液。每孔加入标准品或待测样本100 μL，37 ℃反应45 min。洗板，加入第一抗体工作液，37 ℃反应20 min。洗板，加入酶标抗体工作液，37 ℃反应10 min。洗板，加入底物工作液，37 ℃避光反应15 min，加入终止液。在酶标仪450 nm 处读取吸光度值。

1.2.5实时定量RT-PCR测定肝组织炎症因子mRNA表达 取小鼠肝组织，按照RNA提取试剂盒按说明书提取RNA。逆转录合成cDNA。以β-actin 为内参进行荧光定量PCR扩增以检测各组小鼠肝组织中白介素-1β(interleukin-1β，IL-1β)、白介素-6(interleukin-6，IL-6)、肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor，TNF-α)mRNA的表达水平。以2-ΔΔ Ct法表示各目的基因的相对表达量。扩增引物由上海闪晶分子生物科技有限公司合成，引物序列见Tab 2。

Tab 2 List of primers for real-time qPCR analysis

1.2.6Western blot检测MAPKs/ NF-κB相关蛋白表达 取肝组织加入细胞裂解液，进行组织匀浆，离心收集上清提取细胞蛋白。采用BCA法进行蛋白定量。将蛋白样品加入上样缓冲液，95 ℃孵育5 min进行蛋白变性，上样至聚丙烯酰胺凝胶进行电泳分离，电转至PVDF膜。封闭1 h后，分别以一抗(1 ∶1 000)4 ℃孵育过夜，二抗(1 ∶5 000)室温孵育 1 h。电化学法显影后，采集条带并进行灰度分析。

2 结果

2.1 各组小鼠血清血脂、转氨酶水平AS模型组小鼠血清TC、TG、ALT、AST较正常对照明显升高(P<0.05)。与MOD比较，Sal B、ATO明显降低TC、TG、ALT、AST(P<0.05)(Tab 3)。

Tab 3 Comparison of serum lipids and transaminase levels in each group of

2.2 各组小鼠主动脉根部粥样硬化斑块面积、肝组织病理改变AS模型组小鼠主动脉粥样斑块面积较正常对照组明显增大。与MOD比较，Sal B、ATO干预后明显减小斑块面积(P<0.05)。CON小鼠肝组织结构正常且清晰，MOD小鼠肝组织结构紊乱，出现炎性细胞浸润灶、气泡性脂肪变。与MOD对比，Sal B、ATO组小鼠肝组织病理变化得到明显改善(Fig 1)。

Fig 1 Histopathological figure of each group of

2.3 丹酚酸B对各组小鼠炎症因子及肝组织炎症蛋白表达的影响ELISA法检测各组小鼠血清IL-1β、IL-6、TNF-α含量，结果显示，MOD小鼠血清IL-1β、IL-6、TNF-α含量明显升高(P<0.05)；Sal B、ATO明显降低血清IL-1β、IL-6、TNF-α的含量(P<0.05)。RT-PCR法检测各组小鼠肝组织IL-1β、IL-6、TNF-α mRNA表达，结果显示，MOD小鼠肝组织IL-1β、IL-6、TNF-α mRNA表达明显升高(P<0.05)；Sal B、ATO明显降低上述炎症因子mRNA表达(P<0.05)(Tab 4)。

Tab 4 Comparison of serum inflammatory factors in each group of

Western blot 检测肝组织炎症蛋白血管细胞黏附分子(vascular cell adhesion molecule，VCAM)、诱导型一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase，iNOS)的表达水平。结果显示，模型组小鼠肝组织VCAM、iNOS蛋白表达明显升高(P<0.01)，Sal B干预后，VCAM、iNOS蛋白表达明显降低(P<0.05)(Fig 2)。

Fig 2 Expression of inflammatory protein in liver tissues of mice in each

2.4 丹酚酸B对小鼠肝脏MAPKs/NF-κB信号通路相关蛋白表达的影响MAPKs/NF-κB信号通路在炎症反应中起到重要作用。Western blot检测小鼠肝组织MAPKs/NF-κB信号通路相关蛋白。结果显示，MOD组JNK、p38、ERK1/2、IκB、NF-κB蛋白的磷酸化水平均明显升高(P<0.01)，Sal B明显下调上述蛋白磷酸化水平(P<0.05)(Fig 3)。

Fig 3 MAPKs/NF-kB signaling pathway related protein expression in liver tissues of mice in each

3 讨论

AS的发病机制与脂质代谢异常、炎症、氧化应激等有关[1]。血脂异常是AS发生发展的独立危险因素。肝脏在脂质代谢中发挥重要作用，是脂肪酸合成和脂质循环的枢纽[3]。临床研究发现，非酒精性脂肪肝病是心血管疾病死亡率的独立预测因素，并与颈动脉内膜-中膜增厚和斑块早发有关[6]。既往有研究发现，“瓜蒌-薤白”明显减少AS小鼠主动脉斑块，减轻肝脏脂滴积累[7]；甘草酸调节肝脏胆固醇代谢，有效阻抑Apo E-/-小鼠AS的发展[8]。本课题组前期研究发现，复方冠心康通过调控肝脏ATP结合盒转运子等分子的表达，改善脂质代谢紊乱，从而改善ApoE-/-小鼠AS[9]。本实验结果显示，Sal B降低高脂饮食诱导AS的LDLR-/-小鼠血清中的TC、TG水平，病理学观察显示，Sal B减少LDLR-/-小鼠主动脉斑块、肝脏脂滴积累，改善肝组织病理改变。这提示Sal B通过改善血脂异常从而控制斑块的形成。

研究发现[10]，肝脏炎症在AS过程中发挥重要作用，导致AS的炎症因子部分来源于肝脏。研究表明[11]，肝脏炎症的发生早于主动脉早期病变形成。过量的脂质摄入会导致氧化应激，诱导肝脏发生炎症反应，激活干扰素γ、IL-1、TNF-α等炎症信号通路，释放炎症因子C-反应蛋白、IL-6等，促进动脉粥样硬化。非酒精性脂肪性肝炎患者比单纯脂肪变性患者更容易发生AS[12]。本实验结果显示，Sal B降低高脂饮食诱导AS的LDLR-/-小鼠血清中ALT、AST及炎症因子IL-1β、IL-6、TNF-α水平，以及肝组织IL-1β、IL-6、TNF-α mRNA表达水平和VCAM、iNOS蛋白表达水平，这提示Sal B通过减轻肝组织炎症缓解动脉粥样硬化。

MAPKs信号通路参与炎症和AS的发展过程[13]。NF-κB是介导炎症反应的关键转录因子[14]。当Toll样受体4受到内毒素、脂肽的刺激，触发骨髓分化因子88依赖途径，快速激活MAPKs/ NF-κB信号通路，上调炎性因子的转录翻译，增加VCAM、iNOS的表达，促进肝脏炎症，从而加重AS[15-16]。研究发现[17]，MAPKs/NF-κB信号通路的过度激活，会促进巨噬细胞向M1型转化，增加活性氧自由基、内质网应激，进一步驱动肝脏炎症。因此抑制MAPKs/NF-κB信号通路是减轻肝脏炎症的有效途径。龚勇珍等[18]研究发现乙酰水杨酸姜黄素酯抑制肝脏NF-κB p65表达，从而下调肝脏炎症因子，改善AS。本研究结果显示，相比于模型组，给予Sal B干预后的小鼠肝组织ERK1/2、JNK、p38、IκB、NF-κB蛋白磷酸化水平有不同程度的下调。说明Sal B可能通过抑制MAPKs/NF-κB信号通路，减轻肝脏炎症。

综上所述，本研究阐明Sal B通过抑制肝脏MAPKs/NF-κB信号通路，减轻肝脏炎症反应，从而缓解动脉粥样硬化，为抗炎性药物、抗动脉粥样硬化药物筛选提供了实验依据。