微小RNA在肺动脉高压PASMCs表型转化中的研究进展

张卫芳，徐 菲,2，陶泽颖,2，刁 倩,2，谢珊珊，李 娟,3，徐睿来

(1.南昌大学第二附属医院药学部，江西 南昌 330006；2.南昌大学医学院，江西 南昌 330031；3.南昌大学医学院药学部，江西 南昌 330031)

肺动脉高压(pulmonary hypertension，PH)是动脉性肺动脉高压(pulmonary arterial hypertension，PAH)、左心脏病变肺动脉高压、肺疾病及血氧不足肺动脉高压(hypoxic PH，HPH)、慢性栓塞或梗塞肺动脉高压以及混合性肺动脉高压的总称[1]。主要病因是肺小动脉原发病变而导致肺动脉阻力增加，最终可导致患者右心衰竭而死亡。自1891年Romberg博士报告了第一例PH病例，至2011年估计全球被诊断PH的患者已多达1亿。PH起病隐匿，无特异性临床表现，除传统的吸氧、强心、利尿、抗凝、扩血管(对于急性肺血管反应实验阴性的患者效果不佳)的综合治疗外，临床上近年来更多地开始使用靶向药物，包括电压门控L型钙离子通道阻滞剂(如硝苯地平、氨氯地平)、5型磷酸二酯酶抑制剂(如西地那非、他达拉非、利奥西呱)、内皮素受体拮抗剂(如波生坦、安贝生坦、马西替坦)和前列环素类似物(如依前列醇、伊洛前列素、曲前列环、赛乐西帕)等，同时也有一些新药如Rho激酶抑制剂、受体酪氨酸激酶抑制剂等正在研究中。但是，目前临床用药只能调控血管功能，无法直接改善肺血管重构异常，无法逆转PH进程，治疗效果依然有限，患者的平均存活期仅有7年[2]。肺血管收缩、细胞增殖和血栓栓塞的形成被认为是PH发病机制的中心环节。业已证明，肺血管重构是所有PH的共同病理特征，主要表现为肺动脉内膜增生、中膜平滑肌细胞增生与肥大、外膜成纤维细胞增殖、细胞外基质增多、原位血栓、不同程度的炎症以及丛状动脉样改变，从而导致肺动脉管壁增厚和管腔狭窄[1]。其中，肺动脉平滑肌细胞(pulmonary arterial smooth muscle cells，PASMCs)增殖/凋亡平衡破坏，以及表型转化所致的PASMCs过度增殖是导致PH时肺血管重构的主要原因[1]。

微小RNA(microRNA，miRNA)是一类进化上高度保守的单链非编码小分子RNA，长度约为18～22个核苷酸，主要通过结合靶信使RNA(messenger RNA，mRNA)的3′非翻译区(3′-UTR)直接降解mRNA或抑制靶mRNA翻译。miRNA与靶mRNA的结合方式有完全结合和不完全结合两种方式[3]，一般在植物体中通过完全互补结合，导致mRNA降解。在动物中主要通过不完全互补结合，这种结合方式一般不影响mRNA的稳定，但可影响其翻译。据估计，miRNA可直接调控人类基因组中至少30%的基因，因此被认为参与几乎所有的生理和病理过程，在胚胎发育、器官建成、组织形成等多种生理过程及癌症发生、血管增生和炎症发生等许多病理进程中发挥重要功能[3]。近年来，越来越多的学者发现，miRNA可通过调控PASMCs表型转化，在PH的发生发展中发挥重要作用，有望成为预防和治疗PH的潜在靶点。本文就调控PASMCs表型转化的miRNA相关研究进展进行综述。

1 PASMCs表型转化

血管平滑肌细胞(vascular smooth muscle cells，vSMCs)的表型具有多样性和可变性特点。在胚胎发育过程中，vSMC由未分化表型(合成型)逐渐分化具有成年特征的分化表型(收缩型)。当血管受到损伤或各种因子刺激时，vSMC又从收缩型转化为合成型，表现为平滑肌标志基因表达下调，合成和分泌能力增强，重新获得增殖和迁移能力，称为表型转化[4]。如Fig 1所示，一般来说收缩型比合成型体积更小，为拉长的纺锤形，含有丰富的肌丝，收缩能力强但DNA合成活性低，合成细胞外基质 (extracellular matrix，ECM)能力差，因此，收缩型vSMC增殖速度十分缓慢且不会发生迁移。合成型的vSMC呈菱形的单倍体样，体积较大，肌丝含量极少，无收缩性但能大量合成ECM、胶原蛋白和骨桥蛋白，细胞增殖能力增强，同时可以发生迁移[4]。vSMC发生表型转化时，SM-特异基因(如α-SMA、SM-MHC、SM22α、h1-calponin等)表达下调，而合成型标志基因(如TM4、SMEMB、OPN、MGP、TSP等)则表达上调。

Fig 1 Schematic diagram of PASMCs phenotypic modulation

心肌素(myocardin，MYOCD)是迄今为止发现的最为关键的抑制vSMCs表型转化的转录因子，其同家族成员还包括心肌素相关转录因子(myocardin-related transcription factors，MRTF)-A和MRTF-B。 MYOCD 和MRTF-A/B作为转录因子共激活因子，主要通过与血清反应因子(serum response factor，SRF)结合，形成MYOCD/MRTF-A/B-SRF三元复合物(ternary complex factors，TCFs)，促进SM-特异蛋白基因转录。另一方面，Elk1、KLF-4或KLF-5等也可作为TCFs的共激活因子，与SRF结合则可促进生长因子基因转录[5]。笔者及其他学者研究均发现，PH时，生长因子或低氧可通过影响多个信号通路(包括miRNA)，最终影响三元复合物的成分，调控PASMCs表型转化[4](Fig 2)。目前已有报道一些miRNA可影响PASMCs表型转化，这些miRNA的表达大多由于生长因子或低氧刺激而改变，我们将其分为生长因子相关miRNA和低氧相关miRNA。

Fig 2 Signaling pathways of PASMCs phenotypic modulation

2 生长因子相关miRNA

血小板源性生长因子(platelet-derived growth factor，PDGF)是一类刺激细胞增殖的肽类生长因子，目前认为是促进vSMC表型转化最强的生长因子。PH时，肺动脉内皮细胞(pulmonary arterial endothelial cells，PAECs)分泌的PDGF显著增加。据报道，PDGF处理PASMCs可显著上调miR-221[6]，miR-24[7]，miR-15b[8]等miRNA，并下调miR-21[9]表达水平，最终导致细胞表型转化。普遍认为骨形成蛋白 (bone morphogenetic protein，BMP)信号可促进vSMC收缩表型，而BMP通路激活可显著下调miR-96[10]的表达。PDGF调控miRNA表达变化的机制可能与拮抗BMP信号通路有关[9]。

2.1 促表型转化生长因子相关miRNAmiR-221在多种肿瘤增生中呈现高表达，可通过调节血管生成、促进vSMCs表型转化等过程导致动脉粥样硬化时主动脉血管重构。在PH中，miR-221可通过下调靶基因c-Kit促进PASMCs表型转化。已知c-kit在细胞内可通过与cArG盒基因结合促进SM-特异基因表达，使细胞保持收缩型[6]。miR-96在膀胱癌、乳腺癌等多种肿瘤增殖和迁移以及胚胎干细胞的多能性维持中发挥作用，此外，还可以通过靶向anillin(ANLN)降低心肌梗死后新生血管生成潜能，下调miR-96表达可以改善心脏内皮细胞生成潜能。肺动脉中，miR-96通过负向调控其靶点Tribbles-like protein 3(Trb3)，从而导致Smad蛋白表达减少，进而促进PASMCs表型转化[10]。Trb3表达的下调又可抑制BMP途径，可能反过来上调miR-96，因此，在PASMCs中miR-96和Trb3之间可能存在负反馈调节。有趣的是，PDGF-BB刺激vSMC后，miR-96表达无显著变化，因此，BMP对miR-96的调节机制是特异性的。miR-24广泛参与急性心肌梗死后心肌细胞凋亡、心肌纤维化及心脏重构等病理进程。PDGF-BB处理诱导miR-24表达，miR-24同样通过靶向Trb3后Smad蛋白表达减少以及TGFβ/BMP信号抑制，促进PASMCs的合成表型[7]。miR-15b的靶基因涉及细胞周期增殖(cyclin)、凋亡(Bcl-2)、侵袭和血管形成(NRP-2、VEGFR-2)等。PDGF刺激PASMCs仅4 h，miR-15b 表达量就变成了原来的两倍[8]。既往研究发现，miR-15b可促进vSMC表型转化，生理状态下直接抑制miR-15b的表达可促进细胞合成α-SMA，vSMC保持收缩表型。该课题组进一步发现miR-15b还介导PASMCs表型转化[8]，但具体机制尚不清楚。

2.2 抑制表型转化生长因子相关miRNA一直以来，miR-21在肿瘤、心血管及肺部疾病等方面的作用受到人们的重视，也是PH血管重构中研究的最多的一个miRNA。但miR-21在PH中不同研究的结果相互矛盾。有学者系统的研究了miR-21，发现无论是PH大鼠肺组织，还是IPAH患者的肺组织及血浆，miR-21表达均下调。在培养的PASMCs，PDGF可显著下调miR-21表达[9,11]。BMP4刺激则可显著上调miR-21的表达[9]。BMP4信号通路在维持PASMCs收缩表型中起着至关重要的作用。BMP受体基因的不表达或灭活突变可导致PASMCs发生表型转化。Kang等[9]发现在PASMCs中，几乎所有胞质分裂作用因子(dedicator of cytokinesis，DOCK)都为miR-21的靶点，BMP4上调miR-21后可通过抑制DOCK4、-5和-7，促使PASMCs维持收缩表型，抑制迁移。PDGF刺激则可通过miR-21/DOCK信号通路促进PASMCs表型转化。已经发现miR-21可作为部分肿瘤的生物标记物，调节其功能也可以用作一种心脏保护策略，那么是否也参与了PH时右心衰竭，也值得我们进一步探讨。

miR-132被认为在中枢神经系统和心血管系统的发育中发挥重要作用。在包括心肌肥厚、高血压、动脉粥样硬化等多种心血管疾病中表达上调。2019年，有学者发现[12]，miR-132在野百合碱诱导的PAH大鼠和PDGF诱导的PASMCs中表达也上调，并可通过靶向磷酸酯酶与张力蛋白同源物(phosphatase and tensin homologues，PTEN)抑制PASMCs增殖，维持PASMCs收缩表型，同时促进细胞迁移。在PH中，miR-132的促迁移作用有助于丛状病变的形成，但它在体内的抗增殖和分化作用似乎与体外研究结果相矛盾。可能是因为PASMCs的增殖是由其他关键因素诱导的，也可能是因为miR-132的分化作用可能促进SMC和SMC样细胞的形成。而抑制miR-132能否预防和逆转PAH的进展仍需进一步研究。

miR-182在肿瘤性疾病、神经系统和免疫系统疾病、心血管疾病中都有重要作用。大多证据支持miR-182在细胞增殖、血管生成和侵袭及癌症远处转移中发挥促进作用，在癌症临床诊断、病情评估、治疗和预测癌症预后中具有应用潜力。有报道miR-182在大鼠主动脉平滑肌细胞中有抑制表型转化的作用，同时还参与调节神经细胞表型转化。最近，哈尔滨医科大学徐教授团队[13]在离体PASMCs实验中发现miR-182还可通过靶向成纤维生长因子9(fibroblast growth factor 9，FGF9)，抑制PASMCs表型转化，但无论从网络生物信息学分析还是在体实验，尚未直接证明miR-182在PH血管重构中的作用。

3 低氧相关miRNA

缺氧导致miRNA表达变化的机制可通过低氧诱导因子-1(hypoxia inducible factors-1，HIF-1)依赖途径和HIF-1非依赖途径介导。据报道低氧诱导PASMCs表型转化的同时，miR-23a[14]、miR-9[15]、miR-214[16]、miR-20a[17]表达均上调，而miR-449[18]、miR-206[19]、miR-124[20]、miR-30c[21]和miR-140[22-23]表达均下调。

3.1 促表型转化低氧相关miRNAHIF-1是调节氧稳态的重要介质，是在低氧状态下能够发挥活性的核转录因子。HIF-1由α和β两个亚基组成，HIF-1α亚基被称为HIF-1的活性亚基，是它所特有的。HIF-1的生理活性主要取决于α亚基的功能和表达。许多研究证实，HIF-1在多种类型PH，尤其是HPH时表达显著上调并发挥了重要作用[15]。缺氧开始时，HIF水平的升高可启动100多个基因的转录，这些基因影响和调节多种肺血管功能，如活性氧生成/氧化应激、血管生成、血管细胞迁移、代谢、增殖、生存和表型转化。其中，HIF-1α可上调miR-23a[14]和miR-9[15]的水平促进PASMCs表型转化。miR-23a参与多种癌症发展，并促进心脏肥大和拮抗肌肉萎缩，但miR-23a抑制SM-特异蛋白表达的下游作用靶点目前还未发现。miR-9随细胞类型特异性发挥促进或拮抗增殖的作用，并可靶向人类ACAT1基因，减少巨噬细胞泡沫细胞形成，参与动脉粥样硬化过程的调节，MYOCD是miR-9的直接下游靶点，miR-9抑制MYOCD后可直接抑制SM-特异蛋白的基因转录[15]。

同miR-9类似，在HPH时，miR-214[16]和miR-20a[17]均表达上调，miR-214参与多种癌症进程，并是肝、肾、心肌等纤维化的重要调节剂，在心肌肥厚或衰竭心脏中发挥促肥厚调节性作用。miR-20a的表达失调参与多种癌症发展，并可能通过靶向调控CNN1影响血管内皮生长因子活性和迁移以及VEGF的表达，影响动脉粥样硬化斑块的形成和发展。两者通过负向调控MYCOD信号通路促进PASMCs表型转化，但它们的调控MYCOD的机制各不相同。miR-214通过抑制直接下游靶点MEF2C直接抑制MYCOD-LMOD1信号通路，而miR-20a则是通过靶向结合PKG1，促使Elk-1活化，竞争MYOCD与SRF结合位点，最终导致MYOCD-SRF复合物解离，SM-特异基因表达程序中止。

3.2 抑制表型转化低氧相关miRNAmiR-449[18]、miR-206[19]、miR-124[20]、miR-30c[21]和miR-140[22-23]在低氧诱导的PH动物模型的肺血管或PASMCs细胞模型中均表达下调，且通过各自靶点可抑制PASMCs表型转化。

miR-449簇位于癌症易感位点，通过作用多种信号因子(包括Notch通路、VEGF、p53等)抑制肿瘤的生长、入侵和转移，并促进细胞凋亡和分化。有学者对HPH大鼠肺血管进行了全基因组miRNA测序分析，发现miR-449下调[18]。 miR-449抑制PSAMCs表型转化的作用通过直接靶向调控c-Myc，促使SM-特异蛋白(SM-22α、myosin和calponin)表达来介导[18]。此外，miR-449通过靶点c-Myc调控PASMCs线粒体功能[18]。

miR-206在胃癌、乳腺癌、肝癌、肺癌等组织中异常表达，是许多癌症的转移抑制因子，同时研究发现，miR-206通过靶向Notch3基因来调控骨骼肌细胞的增殖和细胞周期阻滞。小鼠低氧6周后分离PASMCs进行miRNA检测，发现miR-206表达显著下降，给予miR-206可显著通过抑制Notch3通路提高PASMCs中SM-特异蛋白(α-SMA、calponin)的表达[19]。

miR-124是大脑中一种丰富的miRNA，在正常组织中呈现高表达，而在许多癌症中(如结直肠癌、乳腺癌、胃癌、胰腺癌等)表达下调。在帕金森病、亨廷顿舞蹈症、缺血性中风和PH等疾病中，miR-124表达水平也下调。在体上调miR-124可以延缓上述疾病进程。活化T细胞核因子(nuclear factor of activated T cells，NFAT)信号通路为miR-124的直接下游靶点，而每个NFAT成员(NFATc1、NFATc2和NFATc3)的过度表达导致α-SMA显著减少，表明miR-124可通过调控靶点NFAT抑制PASMCs表型转化[20]。

miR-30c在人类多种肿瘤组织中呈低表达，是前列腺癌、乳腺癌及膀胱癌等的潜在生物标志物，提示miR-30c在诊断和治疗方面有开发前景。低氧刺激PASMCs可显著下调miR-30c的表达。进一步研究其机制发现，miR-30c可直接结合到PDGFRβmRNA的3′-UTR来减少PDGFRβ表达，并发挥抑制PASMCs表型转化的作用。有趣的是，miR-30c介导PDGFR的表达变化只发生在低氧，而不是在PDGF刺激的细胞中[21]。此外，miR-30c还可通过靶向XBP1、TGF-β1、CTGF等影响心肌凋亡、氧化应激和炎症，参与心室重塑，那是否也可参与PH时右心室重塑呢？

miR-140被发现在乳腺癌、非小细胞肺癌以及骨关节炎等疾病中发挥重要作用，也可作为冠心病发生的预测因子。有研究发现miR-140在先天性PH[22]和PAH患者[23]肺组织中表达显著下调。先天性PH患者中，肺动脉压力越高的患者miR-140表达量越低[22]。使用脂质体将miR-140送入肺部治疗的PH大鼠血流动力学指标降低、肺血管重构降低[24]，进一步研究发现miR-140靶点为Smurf11，根据这一靶点研制的选择性Smurf11抑制剂可能是PH的新疗法。体外对PASMCs低氧也可显著下调miR-140的水平。上调miR-140可增加SM-特异蛋白，如α-SMA、SM22和calponin表达显著增加，表明miR-140是维持PASMCs表型所必需的miRNA。已知Wnt-1和Dnmt1均为miR-140直接靶点，Wnt-1介导了缺氧诱导的PASMCs增殖迁移，并且可以抑制SM-特异蛋白的表达。Dnmt1也可通过抑制SOD2促进低氧诱导的PASMCs表型转化[23]。PH时，miR-140下调介导的PASMCs表型转化可能与这两个靶点有关。

miR-17～92簇包含miR-19a/b和miR-17/20a，miR-17～92在IPAH和其他类型的PAH患者的PASMCs中均下调[25]。miR-17～92在HPH小鼠早期表达上调，但在晚期表达则下调[25]。通过平滑肌特异性敲除miR-17～92可显著改善小鼠HPH进程，降低肺动脉压力，在这些小鼠额外给予重组miR-17～92后则抵消了敲除的改善效果。有趣的是，体外结果发现，miR-17～92具有同时促进PASMCs增殖和分化两种功能。其调控PASMCs表型转化的机制与myocardin通路无关，但依赖TGF-β信号，但额外给予正常小鼠miR-17～92却不足以诱发小鼠发生PH。提示PASMCs中的miR-17～92是PH病理发生发展过程中一个重要的参与者，但不是绝对控制者。已证实miR-17～92的直接下游靶点有纤溶酶原激活物抑制物1(PAI-1)、PDLIM5(PDZ and LIM domain 5)和PHD2(prolyl hydroxylases 2)。其中，miR-19a/b可通过抑制PAI-1后激活TGF-β/Smad2/calponin信号通路，进而促进SM-特异蛋白表达增加[25]。而miR-17/20a则可通过抑制PDLIM5激活TGF-β3/Smad3信号通路促进SM-特异蛋白表达增加[25]。此外，miR-17/20a还可通过调控PDLIM5间接抑制PAI-1。体内外研究相矛盾的结果提示，miR-17～92促进PH病理生理进程主要是通过除表型转化以外的其他机制，如PAECs和PASMCs增殖[25]来实现的。miR-17-92在PH进展中的确切作用有待进一步研究。

miR-let-7在心血管系统中表达丰富，在许多心血管疾病如心肌肥大、心肌纤维化、心肌梗死、血管生成、动脉粥样硬化以及高血压中表达异常，我们团队运用miRNAs网络药理学发现let-7家族同时参与了TGF-β/ BMP、低氧和炎症3个功能通路[26]，还发现let-7g在低氧PH大鼠中表达下调，它可以通过靶向c-Myc抑制低氧诱导的PASMCs增殖[27]，而miR-449正是以c-Myc为靶点，促进SM特异性蛋白的表达，抑制PASMCs的表型转化[18]，let-7g是否也可以通过靶向c-Myc抑制PASMCs的表型转化，值得探究。另外，我们进一步还发现let-7g在PH时可负向调控靶点LOX-1[28]，LOX-1又可通过ERK1/2-Elk-1/MRTF-A-SRF信号通路促进PASMCs表型转化[4]。不仅如此，众所周知，MAPK通路激活后，TCFs被激活，TCFs可通过重塑含CArG box启动子的染色质、分离SRF和降低肌钙蛋白表达来促进vSMCs发生表型转化。我们团队通过生物信息学预测发现let-7g可与MEKK1靶向结合，从而调控MAPK通路。基于以上发现我们推测，let-7g很可能也具有抑制PASMCs表型转化的作用，而这也是我们未来的研究方向。

4 总结与展望

PH是一种进行性疾病，预后差且无有效的治疗手段。全球学者一直致力于探讨其发病机制，为PH的防治提供新的靶点。近十几年来国际上对miRNA的研究突飞猛进，miRNA的发现开辟了疾病发生发展机制研究的新领域。目前对miRNA的研究仍多聚焦在肿瘤领域，发现许多miRNA可以作为肿瘤的生物标志物，参与肿瘤的诊断、治疗和预后评估。近年来逐渐发现，miRNA参与体内许多病理生理过程，近期研究表明miRNA与PH的关系非常密切[3]，并根据信号通路将其分为生长因子相关miRNA、炎症相关miRNA和低氧相关miRNA[29]。研究PH相关miRNA有重大意义，增强对PH相关miRNA的研究有助于阐明发病机制、研发更有效的靶向药物以及辅助早期诊断。

同其他的领域相比，miRNA在PH发生发展这一领域的研究相对滞后，发现的miRNA相对较少，且miRNA对PAECs和PASMCs离子通道影响的研究几乎是空白。但是，这对我们来说，也是一个难得的机遇。目前临床治疗中主要应用的药物仅能减轻症状，无法逆转疾病进程、直接改善重构异常。因此，研发新的药物迫在眉睫。由于miRNA分子结构简单，分子量小，易于合成和修饰等特点，必将成为新一代治疗PH的分子药物。本文综述了miRNA通过调控表型转化在PH肺血管重构中的作用，并归纳了潜在的作用靶点(Tab 1)，有望以PASMCs表型转化为中心，为研究者揭示miRNA在PH发生发展中的全新作用。一些动物实验已经证明，一些靶向调控miRNA的药物可以延缓甚至逆转PH进程，如在野百合碱诱导的大鼠PAH模型中，气道雾化miR-140-5p模拟物或miR-223模拟物可改善PAH。但是如何让miRNA精准进入肺组织的同时避免进入其他组织产生不良反应，以及如何在细胞中保持稳定性，还需要进一步研究。同时，miRNA在体内作用复杂，可能有多个靶点，相互构成网络，影响目标miRNA是否会带来其他影响还需要仔细验证，从这个角度讲，一些对其他器官影响较小而在PH中作用效果明显的miRNA或许更有研究价值。此外，对于只在细胞层面探究了对PASMCs表型转化的影响的miRNA(如miR-15b、miR-182)，还需要进一步通过动物实验确证其在PH中的变化及对血管重构的影响。

Tab 1 miRNA influencing PASMCs phenotypic switching

目前，PH临床诊断中没有明确的生物标志物，而最近的报道表明，细胞外miRNA与蛋白质复合物结合，因此，它们在循环中不容易被RNase降解，表达稳定且丰富，可作为PH诊断或早期检测的潜在生物标志物。但也要注意，有些特异性不高的miRNA并不适合作为生物标志物。如miR-21已被超过29种疾病称为特定的预测或预后生物标志物[30]，因此，miR-21的变化不能很好的指示PH疾病诊断及进程。寻找与PH疾病相关且特异的miRNA也是未来我们需要努力的方向。