内质网应激在甲基苯丙胺诱导神经毒性机制研究进展

王 婵，许 悦，林纾丞，澹 忆，张树威，张慧洁，曾晓锋，李 桢

(昆明医科大学法医学院，云南 昆明 650500)

甲基苯丙胺(methamphetamine，METH),俗称“冰毒”。因为METH具有高度精神依赖性、神经毒性和高复吸性等特点。目前，在我国METH已经超过传统非法精神活性物质，成为最广泛滥用的一种非法的精神兴奋剂。它通过各种因素和各种复杂途径作用于中枢神经系统，对其造成不可逆的损害，并引起记忆、认知等功能障碍的并发症[1]，上述并发症与METH诱导的神经毒性息息相关。METH的神经毒性机制仍未完全阐明，目前多从ERS、氧化应激、细胞凋亡、神经炎症、线粒体应激以及细胞自噬等方向进行研究。本文从METH诱导神经细胞发生ERS，以及ERS与神经毒性的关系进行综述，目的是对ERS和UPR信号通路进行阐述，并对ERS与细胞凋亡、自噬之间的关系进行总结，为METH的神经毒性机制的研究以及防治提供新的思路。

1 内质网应激

内质网(endoplasmic reticulum，ER)凭借自身强大的膜结构以及膜上大量的酶，在调控各种细胞正常生理功能中起着基础作用，例如蛋白质易位、蛋白质折叠、钙稳态和脂质生物合成[2-5]。

内质网应激(endoplasmic reticulumstress，ERS)在外界刺激下，细胞增加了折叠蛋白质的需求，使得ER功能发生紊乱，并导致未折叠或者错误折叠的蛋白质异常蓄积于ER腔中。这是细胞面对ER稳态被破坏时做出的一系列适应性反应。这种异常蓄积驱动了未折叠蛋白反应(unfolded protein response，UPR)激活，目的是保护细胞免受压力，减少生物合成负荷，并有助于重建细胞稳态。

UPR涉及葡萄糖调节蛋白78(glucose regulating protein 78，GRP78/Bip)和3种位于ER膜上跨膜传感器：肌醇需求因子1(inositol-requiring enzyme 1，IRE1)、类蛋白激酶内质网激酶(protein kinase R-like ER kinase，PERK)和活化转录因子6(activating transcription factor 6，ATF6)。GRP78/Bip是属于HSP-70家族，目前GRP78/Bip被视为ERS的标志蛋白之一。正常情况下，GRP78/Bip与IRE1、PERK、ATF6高度结合，导致3种跨膜传感器生物活性丧失[3]。当发生ERS时，GRP78/Bip从3个跨膜传感器分离出来，随后竞争性结合这些错误折叠蛋白质暴露疏水结构域，并使得3种跨膜传感器接受异常信号，分别激活UPR。

在UPR中，PERK通过二聚化和自身磷酸化翻译下游因子真核翻译起始因子2α(eukaryotic translation initiation factor 2 alpha，eIF2α)，eIF2α会导致ER腔内蛋白质合成受到抑制。ATF4是一种PERK下游蛋白，其长期表达可诱导CHOP表达增加。活化的IRE1 可通过参与多种mRNA剪接，降低ER中错误折叠的蛋白质，其中活化后的IRE1利用自身二聚化和内切核糖核酸酶活性的特性，催化XBP1 mRNA的剪接合成为sXBP1[2, 6]。同时，ERS的第三个跨膜传感器—ATF6易位到高尔基体，其在高尔基体上被位点-1蛋白酶(S1P)和位点-2蛋白酶(S2P)切割，进而产生活性转录因子，该转录因子可易位到细胞核并调节ERS相关基因(CHOP、GRP78/Bip和ERAD)成分等基因。上述3条信号通路的激活具有多种效应：减少蛋白翻译、改善ER合成折叠新蛋白质的功能和清除错误折叠的蛋白[7]。

2 METH与内质网应激

Jayanthi等[8]于2004年最先报道METH诱导小鼠神经细胞发生ERS。随后，于2009年进一步提出，D1受体的抑制剂SCH23390可以减轻METH诱导小鼠纹状体神经细胞ERS，说明METH可能通过D1受体诱导神经细胞发生ERS。Takeichi等[9]证实低剂量METH能够诱导小鼠中脑神经细胞同样发生ERS。Hayashi等[10]报道METH给药后大鼠VTA区神经细胞发生ERS。Irie等[11]报道1mM METH处理CA TH.a细胞0～48 h后，GRP78基因转录增加。Qie等[3]发现，METH处理BMVEC细胞导致ERS相关蛋白GRP78、p-PERK、ATF6以及p-IRE1蛋白呈时间依赖性上调。METH处理C6细胞可导致ERS相关蛋白ATF6、p-PERK、p-IRE1出现高表达[6]。Ankit等[2]同样证实METH可通过ATF6、IRE1以及PERK 3条途径的激活，进而介导星形胶质细胞的Ⅰ型程序性死亡。此外，不仅是在中枢神经系统，ERS也可以通过UPR信号通路引起其它系统功能障碍。METH作用于大鼠肺组织后，可激活PERK/eIF2α/ATF4通路造成肺组织的慢性损伤[12]。另外，Wang等[13]也发现，METH不仅降低了大鼠肺组织中Nrf2及其相关的抗氧化基因的表达水平，还增加了GRP78的表达以及PERK/eIF2α/ATF4/CHOP的表达水平，这一结果可被抗氧化剂TBHQ逆转。这提示METH诱导的氧化应激可以加重肺组织的ERS，并进一步激活PERK信号通路。

以上研究提示，METH可引起机体发生持续的ERS，机体会自动激活IRE1、PERK和ATF6相关的UPR信号通路，去对抗这种持续ER功能受损带来的不良后果。UPR致力于修复内环境稳态的同时，还通过凋亡、自噬等信号转导通路对过度损伤的细胞进行清除。但过度的细胞凋亡、自噬又是很多疾病发生、发展的根本原因。

3 内质网应激在METH诱导细胞凋亡中的作用机制

细胞凋亡(apoptosis)是一种复杂的生理性细胞死亡机制，是人类和其他生物正常生长发育所必需的过程。在应激条件下，如氧化应激和DNA 损伤反应，对于具有高增殖率和高表达促凋亡基因的细胞来说，细胞凋亡可以快速发生。目前，已知细胞凋亡的途径有：外源性途径(死亡受体途径)以及内源性途径(线粒体途径、ER途径)。已有较多研究表明在过度ERS反应后期可发生细胞凋亡，ER通过调节细胞凋亡加重神经细胞损伤，从而加速METH诱发的精神疾病和神经退行性变的病理过程。

ERS途径参与METH诱导凋亡途径的机制：

3.1 激活CHOP 途径CHOP的激活是近些年来的研究ERS途径介导细胞凋亡的热点。CHOP由DDIT3基因编码，是CCAAT/增强结合蛋白家族(CCAAT/enhancer binding proteins，C/EBPs)成员之一[12]。CHOP具有两个重要作用。一是作为ERS标志蛋白证明ERS参与损伤过程，二是可作为促凋亡因子。在正常生理状况下，CHOP蛋白表达量极低；然而，在包括ERS在内的多种病理条件下，CHOP的表达急剧上升和细胞凋亡被激活，这个过程可以发生在各种类型的细胞中[2, 5]。

Qie等[3]利用BMVEC细胞为体外模型的研究对象，发现METH可通过UPR 3种信号通路激活CHOP蛋白,导致细胞凋亡和BBB内皮细胞损伤。Pawaris等[4]发现METH处理SH-SY5Y细胞可诱导ERS相关基因(CHOP和剪接的XBP1)呈剂量和时间依赖性增加，进而导致SH-SY5Y细胞发生凋亡。METH处理星形胶质细胞可导致ATF6、PERK以及IRE1通路的激活，这3种机制会启动相应下游信号通路，进一步累积CHOP蛋白从而诱导细胞凋亡[2]。综上所述，CHOP激活代表了UPR的3个主要信号转导通路的融合。此外，METH可通过CHOP-Trib3途径参与多巴胺能神经细胞凋亡；敲低CHOP基因后，Xu等[14]观察到METH诱导多巴胺能神经细胞凋亡水平出现显著的下降。Chen等[15]发现METH处理星型胶质细胞后，ERS被激活，METH可通过PERK-eIF2α-ATF4-CHOP途径，促进星形胶质细胞分泌LCN2(属于脂质运载蛋白家族，与人脑中的细胞死亡有关)。而游离的LCN2与神经细胞表面的LCN2R结合引起神经细胞凋亡。Yang等[5]研究表明，METH可使小鼠VTA、NAC脑区的CHOP、GRP78含量明显升高，同时，在Trx-1(硫氧还蛋白-1，过表达可阻断METH诱导的奖赏效应)高表达转基因小鼠中，CHOP、GRP78含量出现下降。说明ERS是METH损伤小鼠VTA、NAC脑区的重要机制，并且Trx-1蛋白是ERS的上游负调控因子。由此可见，通过抵抗CHOP信号通路可抑制ERS对中枢神经系统损害从而起到保护中枢神经系统的作用。

以上研究表明，CHOP表达的增加是诱导ERS相关的凋亡的关键环节之一。

3.2 激活caspase-12 途径caspase级联反应在细胞凋亡信号转导中处于关键地位,是诱导细胞不可逆地走向凋亡的最后环节。caspase-12是一种位于ER膜上的具有代表性分子，可通过ERS调节细胞凋亡[16]。正常状态下，caspase-12位于ER外膜上处于失活状态。当细胞无法修复自身的损伤时，pro-caspase-12可被特异性水解酶水解成caspase-12，caspase-12以活性形式进入胞质将caspase-9裂解，被裂解的caspase-9具有生物学活性。激活的caspase-9会驱动下游的caspase-3激活，最终诱导细胞凋亡[4]。已有研究表明，METH引起神经细胞凋亡与caspase-12有关。Beauvais等[17]发现METH可以诱导小鼠纹状体神经细胞发生ERS以及线粒体功能障碍，同时可使裂解的caspase-12蛋白含量增加。然而这种现象能够被D1受体抑制剂特异性阻断。Yang等[5]给予METH后，小鼠脑中ERS标记蛋白GRP78表达水平明显升高，同时发现pro-caspase-12的表达显著降低，caspase-12出现活化。说明METH会使 GRP78激活导致ERS，通过caspase-12途径诱导细胞凋亡。CDK5(脯氨酸导向的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，对Tau蛋白具有特异性)蛋白可促进METH上调SH-SY5Y细胞和SD大鼠海马区p-Tau蛋白表达，进而破坏内质网相关降解途径，同时可观察到p-PERK、caspase-12表达水平升高。敲除CDK5后，上述指标发生逆转。说明在METH诱导的细胞凋亡、ERS以及Tau蛋白磷酸化3者之间的存在密切联系[1]。另外,褪黑素可缓解METH诱导的ERS相关信号通路的表达，降低caspase-12和caspase-3的表达，减少细胞的凋亡[4]。

由此可见，caspase-12的激活在ERS介导的细胞凋亡的过程中具有关键作用,并且可能成为治疗干预METH导致神经毒性的有效手段。

4 内质网应激在METH诱导细胞自噬中的作用机制

自噬(autophagy)是一个机体自我吞噬分解代谢过程，目的将自噬底物(多余蛋白质、特定细胞器、病原体)输送到溶酶体与其相融合，完成自噬底物的分解，同时进行代谢副产物的回收利用。此过程典型特征是“自噬小体”的形成。从自噬小体的启动、成熟、直到与溶酶体的融合，是一个复杂的过程。该过程受30多个自噬相关基因调控[18]。

近些年研究发现，不管自噬在神经系统中“扮演”保护或者损伤的角色，ERS已经成为启动自噬的必要条件之一。Trib3(Tribbles pseudokinase 3)是一种新型ERS标记蛋白，同时也是METH诱导ERS与自噬的连接点。UPR信号通路可激活Trib3蛋白的生物学活性，并且Trib3能够靶向作用于Akt-mTOR信号通路，直接参与自噬过程。在高剂量METH诱导多巴胺能神经细胞自噬的实验中，Xu等[14]发现METH激活了ERS标志蛋白CHOP和Trib3表达，同时抑制p-Akt、p-mTOR表达；而沉默上游因子Nupr1 (一种ERS诱导剂，在ERS条件下显著表达)或C/EBPβ(C/EBPs家族成员之一，调控细胞死亡和存活)发现，CHOP、Trib3表达水平降低，并且下游的p-Akt、p-mTOR表达升高，从而降低自噬标记蛋白LC3Ⅱ/Ⅰ和Beclin 1表达含量。Tabatabaei等[19]发现，长期滥用METH死亡者的纹状体内CHOP、Trib3、NUPR1和Beclin-1、LC3 Ⅱ、caspase-3和ATG5的基因转录和蛋白表达增加，同时可导致大量的神经元细胞死亡。这表明了NUPR1-CHOP-Trib3通路在METH诱导的自噬中的重要性，并且ERS可能充当自噬的上游调控因子[14, 20]。与此不同，Huang等[21]利用ERS抑制剂预处理星形胶质细胞可显著抑制METH促使的LC3-Ⅱ和GFAP(一种星形胶质细胞活化标志蛋白)表达升高。相反，使用自噬抑制剂进行前干预，则会促进METH促使的CHOP和GFAR表达升高。由此可见，在METH处理星形胶质细胞中ERS与自噬之间存在平行调控的关系，并且两者对神经细胞有着不同的激活或者抑制作用。

目前,关于METH诱导神经细胞自噬的研究较多,但鲜有ERS在METH诱导神经细胞自噬中作用的报道。因此，探讨两者之间的分子机制，对进一步阐明METH诱导的神经毒性损伤作用的新机制具有重要理论及实践意义。

现对上文提及的ERS在METH诱导细胞凋亡和自噬所涉及的信号通路进行总结，如Fig 1所示。

Fig 1 Signaling pathway of ERS in METH induced apoptosis and autophagy

5 药物在METH诱导细胞ERS中的干预

5.1 褪黑素褪黑素(melatonin)是由松果体合成和释放的一种天然的胺类激素。褪黑素除了能调节机体的昼夜周期外，还因其强大的抗氧化作用而闻名。研究结果表明METH通过增加ERS相关蛋白(p-PERK、p-eIF2α、p-IRE1、ATF6、XBP-1和Bip)的表达，激活下游的CHOP和caspase-12，最终促使胶质细胞发生不可逆的凋亡。而褪黑素逆转METH诱导的这一变化[6]。Pawaris等[4]同样证明了褪黑激素预处理可减轻METH诱导的ERS相关基因的过表达、caspase-12、caspase-3的裂解以及神经元凋亡。以上研究结果提示褪黑激素具有减轻METH诱导细胞发生ERS的作用。

5.2 PFT-αPifithrin-alpha(PFT-α)是一种p53抑制剂，因其对保护宿主细胞免受放疗和化疗的毒性，所以常用于肿瘤方面的治疗。最近，在脑缺血灌注、帕金森病、阿尔兹海默模型中，已经证明PFT-α减轻它们对神经元的损害，因此PFT-α具有神经保护特性。Chen等[22]发现，PFT-α可以通过抑制p53易位进入细胞核，降低CHOP表达水平，并利用过表达GLuc-SerCaMP的Sh-sy5y细胞模型证明PFT-α可通过影响ER中钙离子的稳态，从而诱导多巴胺能神经元凋亡。由此可提示PFT-α通过抑制p53核异位和ERS从而拮抗Meth介导的多巴胺能神经元变性。

5.3 分子氢分子氢(molecular hydrogen)是一种具有药用价值的无毒分子，其除了具有抗氧化作用外，分子氢还可通过减少炎症和凋亡,从而提供细胞保护。近年来，在中风、TBI、PD和AD等病理状态下，分子氢已表现出对脑部的显著保护作用。另外，已有研究表明，分子氢不仅能抑制METH引起的空间学习障碍和记忆丧失，还显着抑制了神经细胞中Bax/Bcl-2的比值、caspase-3、GRP78、CHOP、p-NF-κB、p65蛋白的表达水平。除此之外，分子氢还显著降低了IL-6和TNF-α的含量[23]。可见分子氢通过抑制神经细胞ERS、氧化应激、凋亡以及神经炎症从而减弱METH的神经毒性。

5.4 表儿茶素表儿茶素(epicatechin，EC)是一种在绿茶、葡萄籽、杏子和草莓等植物中含量最高的黄烷醇化合物。EC具有广泛的药理学价值，如具有抗癌作用、保护心血管系统和神经系统的作用以及减少氧化应激和炎症的作用。现已证实，EC可进入中枢神经系统，进而抑制NADPH氧化酶表达、清除ROS以及促进抗氧化酶生成从而防止因为氧化应激，短暂或永久性缺血引起的神经系统的损伤。然而，在Kang等[24]的研究中发现与此相似的结论。使用EC提前预处理HT 22细胞，不仅可以减弱在METH作用下HT 22细胞中ROS生成和MAPK活性、CHOP表达以及D4/5受体表达，同时还能阻止caspase级联效应，最终抑制细胞凋亡。这证实了EC对METH诱导的氧化应激和ERS所致神经细胞毒性具有保护作用。

5.5 香树素香树素(aromadendrin)是从雅洁缅茄木、流苏树以及西伯利亚红松中提取的黄酮类化合物。目前研究证实，香树素具有清除ROS、抗肿瘤和抗炎等特点。Lee等[25]证实，METH不仅能够诱导SH-SY5Y细胞发生ERS，导致CHOP、C/EBPβ以及ATF6 mRNA表达上调，还能够通过PI3K/AKT/mTOP途径显著升高自噬相关蛋白LC3、Beclin1，除此之外，METH还可增加caspase-3、caspase-7、Bax(促凋亡蛋白)表达水平以及降低Bcl-2(抗凋亡蛋白)表达水平，而香树素可以改变METH诱导的这一系列现象。由此可见，香树素可明显减弱METH诱导细胞ERS、自噬和凋亡的过程，从而降低METH的神经毒性。

褪黑素、PFT-α、分子氢、表儿茶素以及香树素通过自身的特性抑制不同的ERS信号分子减轻了神经细胞的损伤，最终改善了METH的神经毒性。因此药物作用机制以及ERS启动发生发展过程需要进一步探索，这可能为药物特异性抑制METH神经毒性提供新的防治策略。

6 小结与展望

METH可以导致神经细胞中未折叠蛋白蓄积或钙离子失衡引起ERS，适度的ERS可以缓解ER中的压力，持续性的ERS会加重ER的负荷，通过UPR信号通路诱导细胞走向死亡。近些年研究表明，UPR信号分子可以通过激活CHOP、caspase-12两种途径介导神经细胞凋亡。另外，ERS在METH诱导神经细胞自噬同样起到重要作用，但目前对ERS调控自噬的机制报道较少。并且针对METH滥用诱导神经细胞发生ERS的药物在治疗其诱发的神经毒性中具有较良好的医学前景。因此，深入了解ERS的调控机制，对于METH的神经毒性防治具有积极意义。