北京市1 株猫传染性腹膜炎病毒的分离鉴定及遗传进化分析

贾媛媛，吴宗霖，范玉华，周常喜，殷桂彬，宋 健，李 佳，姜代勋，陈 武

（1.北京农学院动物科学技术学院，北京 102206；2.兽医学中医药北京市重点实验室，北京 102206）

猫传染性腹膜炎（feline infectious peritonitis，FIP）是一种渐进性、高致死性疾病[1]，可发生在以幼猫和老年猫为主的各年龄段家猫，野猫和猎豹也是易感动物[2]。FIP的病原为猫冠状病毒（FCoV）。基于临床症状及产生的病理变化不同，FCoV 分为猫传染性腹膜炎病毒（FIPV）和猫肠道冠状病毒（FECV）两个生物型[3-4]。FECV 在猫肠道中普遍存在，通常导致患猫出现轻微的肠道症状，一般能够自愈，死亡率低。而感染 FCoV 的猫中，5%～12%将患上FIP[5]。

FIPV 在分类上属于套式病毒目（Nidovirus）冠状病毒科冠状病毒属，为单股正链、不分节段的RNA 病毒。FIPV 有4 种主要结构蛋白，即刺突蛋白（S 蛋白）、膜蛋白（M 蛋白）、小包膜蛋白（E蛋白）和核衣壳蛋白（N 蛋白），以及5 种特异性辅助蛋白（3a、3b、3c 和7a、7b，以下简写为7ab）[6]。有研究[7]显示，FIPV 和FECV 的区别很大程度上是由S、3c、7ab 蛋白基因发生突变引起的。为了掌握北京市FIPV 与国内外毒株基因型之间的差异性，本研究对临床FIP 阳性病例感染毒株进行了分离鉴定和不同基因分型序列分析，以期丰富我国FIPV 分子流行病学资料，为该病防控提供参考。

1 材料与方法

1.1 临床病料采集与处理

病料来自经北京市动物医院临床诊断并确诊为FIP 的新近死亡猫，或经宠主遗弃后实施安乐死的患猫。

无菌采集患猫腹水样品，一部分用本实验室建立的反转录聚合酶链式反应（RT-PCR）进行病原检测；另一部分经离心（4 ℃，12 000 r/min，15 min）和过滤除菌（0.22 μm PES 滤器）后，分装于无菌的1.5 mL EP 管中，用封口膜封口，置于-80 ℃冰箱备用。

无菌采集患猫各组织样品（心、肝、脾、肺、肾、胃、肠管、气管、食管、膀胱、眼、脑）1 g 于液氮中冷冻1～2 min 后，加入5 倍体积的PBS，充分研磨后离心（3 000 r/min，15～20 min）；在超净台上，取上清经0.22 µm 滤器过滤除菌后分装于无菌的1.5 mL EP 管中，用封口膜封口，置于-80 ℃冰箱中备用。

1.2 CRFK 细胞

CRFK 细胞系，由北京市中瑞动检公司惠赠。

1.3 主要试剂和仪器

Solarbio 10×PBS、DMEM 高糖培养基（含青霉素、链霉素），Gibco 0.25%胰酶、胎牛血清（FBS），均购自北京爱普瑞晟科技有限公司。SteadyPure病毒DNA/RNA 提取试剂盒、SteadyPure 通用型RNA 提取试剂盒、一步法RT-PCR 试剂盒、Evo M-MLV 反转录试剂盒、2×ProTaqDNA 聚合酶、DL 2 000 DNA Marker，均购自湖南艾科瑞科技公司（北京）。

主要仪器：CO2恒温培养箱，Heal Force 公司产品；PCR 仪和电泳仪，BIO-RAD 公司产品；移液枪，Eppendorf 公司产品；凝胶成像仪，上海天能科技有限公司产品。

1.4 病毒分离与细胞病变观察

1.4.1 CRFK 细胞培养 将CRFK 细胞冻存管从-80 ℃冰箱中迅速取出，立即放入37 ℃水浴锅中水浴，并轻轻晃动，待细胞冻存液全部融化后，使用酒精棉擦拭冻存管，将其快速转移至超净台；于超净台上打开冻存管盖，将液体全数转移至1.5 mL EP 管中，盖紧，1 000 r/min，离心8 min；弃掉细胞上清后，加入1.0 mL 预热的含10% FBS 的细胞培养液重悬，后转移至内含3.0 mL 预热细胞培养液的T25 细胞瓶中，轻轻吹打混匀，使细胞均匀分布于细胞瓶底部；在含5% CO2的37 ℃细胞培养箱中培养至细胞贴壁（约12 h），观察细胞是否处于正常生长形态。

1.4.2 病毒分离 参考文献[8]的操作方法进行病毒接种，根据此株病毒特点进行适当调整。具体分离过程：待CRFK 单层细胞贴壁80%～90%后，弃去旧培养基，消化，加入适量无血清培养基重悬；调整细胞密度为106个/mL，将处理好的FIP 阳性病料和细胞重悬液，按照体积比1:10 接种于六孔板中并设置阴性对照；将所有孔保持胰蛋白酶终质量浓度为20 μg/mL，将六孔板置于细胞培养箱中吸附1 h，每隔15 min 轻微晃动；每天观察细胞生长和病变情况，当细胞病变（CPE）达到80%时收取病毒样品，如没有病变则进行盲传，盲传8 代后如仍没有病变，则视为阴性。

1.5 RT-PCR 检测

根据GenBank 中公布的FIPV S 蛋白基因核苷酸序列，利用Primer 5.0 软件设计鉴别引物F/S。上游引物F/S-1：GGCATAATGGTTTTACCTGGTG；下游引物F/S-2：TAATTAAGCCTCGCCTGCACTT。扩增产物大小为142 bp。

使用该引物，对4 例腹水样品进行检测，对阳性样本参考Chang 等[7]和Licitra 等[9]使用的S1/S2、CV 特异性引物进行PCR 扩增，检测S 蛋白的特殊氨基酸残基是否存在突变。参照唐小娟[8]对3c 和7ab 蛋白分别设计的2 对引物3c-1F/3c-1R和3c-2F/3c-2R，7ab-1F/7ab-1R 和7ab-2F/7ab-2R。引物序列如表1 所示，所有引物，由上海生工合成（北京）。

表1 相关引物序列

根据SteadyPure 通用型RNA 提取试剂盒和SteadyPure 病毒DNA/RNA 提取试剂盒说明书，分别提取患猫腹水中RNA，以提取的RNA 为模板进行一步法RT-PCR 扩增；PCR 产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳检测，并对产物进行回收测序。

1.6 F/S、S1/S2、CV、3c、7ab 蛋白基因遗传序列分析

根据测序结果，应用NCBI 检索同源序列，利用MEGA-X 软件中邻接法（Neighbor-Joining）构建遗传进化树，并用Bootstrap 方法重复1 000 次进行检验，其他参数使用默认值；再利用DNAstar、DNAMAN 等生物学软件，对获得的序列进行同源性比对。

1.7 病毒滴度（TCID50）测定

将从阳性病料中分离得到的毒株，用细胞维持液作10 倍系列稀释，分别接种于96 板中的CRFK 细胞。每孔加入不同稀释度病毒液0.1 mL，每个稀释度重复8 孔，同时设置空白和阳性对照孔；将培养板置于恒温培养箱（37 ℃、5% CO2）中吸附1 h 后，添加维持培养液0.1 mL，置倒置显微镜下观察；每天观察2 次，连续观察5 d，观察到明显的CPE 后，按照Reed-Muench 法计算TCID50。试验重复3 次。

2 结果与分析

2.1 毒株分离

将处理过的患猫腹水和各组织接种于CRFK细胞，结果发现均产生细胞变圆、脱落、拉丝、融合等典型CPE（图1）

2.2 RT-PCR 检测

2.2.1 腹水检测 对无菌采集的4 例腹水样本提取RNA 后，应用引物F/S 进行RT-PCR 检测，编号分别为BJ-1、BJ-2、BJ-3、BJ-4，其中BJ-3 和BJ-4 鉴定结果显示为阳性（图2）。

2.2.2 分离毒株检测 对检测为阳性的BJ-3、BJ-4 腹水样本及其各组织病料，在细胞上增殖后收集细胞和上清提取RNA，然后根据引物F/S 进行PCR 检测，结果BJ-3 分离毒株显示为阴性（图3-A），BJ-4 为阳性（图3-B）。将BJ-4 分离毒株命名为FCoV BEJ5-2021（以下简称为B5），并对其进行F/S（图4-A）、S1/S2（图4-B）、CV（图4-C）、3c-1F/3c-1R（图4-D）、3c-2F/3c-2R（图4-E）、7ab-1F/7ab-1R（图4-F）、7ab-2F/7ab-2R（图4-G）等各基因型检测，结果均为阳性。

2.3 F/S、S1/S2、CV、3c、7ab 遗传序列分析

PCR 扩增后，对阳性腹水分离的毒株B5 测序，测序结果首先运用DNAMAN 对3c、7ab 蛋白基因进行全段拼接，再运用MEGA-X 软件对测序所得的F/S、S1/S2、CV、3c、7ab 蛋白编码基因核苷酸序列片段和GenBank 中已发表的国内外参考毒株序列构建遗传进化树，最后利用DNAstar 生物学软件，对BJ-4 分离得到的毒株进行同源性比较。

2.3.1 F/S 序列 从分离毒株B5 扩增得到的通用型F/S 蛋白编码基因，经测序绘制基因遗传进化树并进行同源性比较。由基因遗传进化树（图5）可知：构建的基因遗传进化树中有两个明显的大分支，其中B5 分离株与荷兰2012 年JQ304508.1参考毒株属于同一分支，亲缘关系较近，而与美国和英国UU54、C1Je 等分离毒株属于不同的大分支，亲缘关系较远。由同源性比较结果可知：分离毒株B5 基因核苷酸序列与GenBank 中登录号 为MT250357.1、MT250377.1、MT250353.1 的VGCaFn@14 意大利血清型I 型分离株同源性达到99.8%。

3.3.2 S1/S2 序列 从BJ-4 样品中分离的毒株B5扩增得到的S1/S2 蛋白编码基因序列，根据测序结果绘制基因遗传进化树并进行同源性比较。由基因遗传进化树（图6）可知：基因进化树中有两个大分支，其中B5 分离株S1/S2 蛋白编码基因序列与我国山东YD8 和上海SH1802 分离株同属一个分支，亲缘关系较近，与2004 年我国上海登录号为MT112946.1 的分离株属两个大分支，亲缘关系较远。由同源性比较可知：分离毒株B5 基因核苷酸序列与GenBank 中登录号分别为MT112935.1 和MT112946.1 的我国分离毒株YD8 和SH1802 的同源性分别达到94.3%和94.2%。

2.3.3 CV 序列 从BJ-4 样品中分离的毒株B5扩增得到的CV 蛋白编码基因序列，根据测序结果绘制基因遗传进化树并进行同源性比较。由基因遗传进化树（图7）可知：B5 分离株与我国浙江分离株ZJU1617、德国分离株FECV5、荷兰参考分离株FIPV4 和FIPV 属于同一小分支，亲缘关系较近，与美国UU54 分离株分属两个小分支，亲缘关系较远，而与德国FIPV3F 分离株、荷兰FECV219 分离株分属两个大分支，亲缘关系最远。由同源性比较可知：分离毒株B5 基因核苷酸序列与GenBank 中登录号为HQ738709.1 的荷兰参考分离毒株FIPV369 同源性达到99.3%。

2.3.4 3c 序列 从BJ-4 样品中分离的毒株B5 扩增得到的3c 蛋白全长编码基因，根据测序结果绘制遗传进化树和进行同源性比较。由基因遗传进化树（图8）可知：B5 分离株与2017 年我国黑龙江参考分离毒株亲缘关系比较近，属于同一分支，与丹麦UG-FH8 参考分离株、我国黑龙江HRB 参考分离株亲缘关系较远，分属于两个大分支。由同源性比较结果可知：分离毒株B5 的基因核苷酸序列与GenBank 中登录号分别为KJ665855.1、KJ665843.1、KJ665836.1、KJ665835.1 的德国参考分离毒株FIPV16F、FIPV08A、FIPV03F、FIPV03A 同源性均为98.9%。

2.3.5 7ab 序列 从BJ-4 样品中分离的毒株B5扩增得到的7ab 蛋白全长编码基因，根据测序结果绘制遗传进化树和进行同源性比较。由基因遗传进化树（图9）可知：B5 分离株在7ab 蛋白编码基因上与我国上海参考分离株SH1807、浙江分离株ZJU1617 以及美国参考分离株FCoVWSU791146亲缘关系较近，同属一个分支，而与我国黑龙江参考分离毒株DQ、HRB 亲缘关系较远，分属两个大分支。由同源性比较结果可知：分离毒株B5 基因核苷酸序列与GenBank 中登录号为MT112933.1 的我国上海参考分离毒株（SH1807）和美国参考分离毒株（FIPV-UCD 15b-1）的同源性分别为99.4%和99.1%。

2.4 TCID50 测定

从各组织病料阳性样本中分离病毒后，将分离得到的各稀释度毒株接种8 孔CRFK 细胞，按照Reed-Muench 法计算得到不同病料分离毒株的TCID50。结果（图10）显示：肠管中分离毒株的TCID50最高，为10-6.5/0.1 mL；脾脏次之，TCID50为10-3.37/0.1 mL；再次是腹水，分离毒株的TCID50为10-2.6/0.1 mL；气管中分离毒株的滴度最低，约是肠管中分离毒株的1/106。肝、肾、肾上腺、脑、肺、眼、心肌、食管、胃和膀胱等其他组织中也均分离到病毒。

3 讨论

宠物猫在饲养过程中较少依赖宠物主，使得越来越多的城市工作者选择饲养宠物猫，其饲养量已出现赶超宠物犬的趋势[2]。而FIP 是引起猫死亡的主要疾病之一[10]。北京市已有FIP 流行病学相关研究[11]，但关于FIPV 的研究尚不充分，致病机制尚不明确，且不同地域的FCoV 存在一定差异，目前又缺少对北京市FCoV 毒株的研究，所以进一步解析FIPV 致病的分子机制，掌握毒株的遗传进化关系，对此病的防治具有重要意义。

FCoV 对外界环境抵抗力非常差，对常见的化学试剂和消毒药均较敏感，故较难在体外对其进行分离和传代培养[12]。目前FCoV 分离多采用猫肾细胞系（CRFK）[13]、猫全胎巨噬细胞系（Fcwf-4）[14]和犬直肠癌细胞系（A72）[15]。比较上述不同细胞系，有研究[13]认为，使用CRFK 细胞系分离FCoV 的成功率较高。

本研究对北京市动物医院收集到的4 例疑似FIP 腹水样本进行检测，通过RT-PCR 方法诊断出BJ-3 和BJ-4 两例阳性病例。其中，BJ-3 中未分离出目标毒株，而利用CRFK 在BJ-4 中成功分离出1 株FCoV B5，并观察到典型的CPE。造成此现象的原因可能是，BJ-3 虽然检测为阳性，但是病料中病毒滴度低，收取病毒时存在损耗，造成目的基因不能得到有效扩增。

对B5 分离毒株不同蛋白编码基因片段（S、CV、3c、7ab）进行测序分析，发现该毒株不同基因分型与不同参考毒株的亲缘关系和同源性不同，表明基因进化树分析只能确定其遗传进化关系。

在本试验扩增出F/S 蛋白编码基因的样品中，有1 份腹水样品扩增出3c 蛋白编码基因，但未成功扩增出7ab 蛋白编码基因，经过多次重复PCR反应，也未成功扩增出其他蛋白编码基因片段。造成这种现象的原因首先可能在于引物结合位点的序列变异，使引物不能正常结合，致使检测失败。其次，也可能是病料中病毒滴度很低，提取组织RNA 时逐渐降解导致变为片段化的病毒RNA，使相关基因扩增困难。再次，也可能是组织标本中各个蛋白编码基因RNA 的量并不均等，扩增过程中优先扩增量多的，或者是存在相同RNA 量的几种基因，但是在不同的扩增反应中，扩增效率并不相同，导致相关基因扩增失败[8]。最后一种原因，可能是基因对应的扩增条件不是最优，导致不能检测到目的基因，但是由于PCR 的高检测灵敏度，这种可能性较小。

BJ-4 阳性病例为6 个月龄的雄性英国短毛猫，对其剖检可见各脏器表面大范围弥散性浆膜和实质性肉芽肿，且存在严重的腹腔和胸腔积液。依据本研究对B5 毒株TCID50的检测结果来看，该病毒在患猫肠管中含量最高，脾脏次之。一些研究[16-17]认为，FECV 和FIPV 是独立传播的病毒。然而，越来越多的证据支持突变假说，FIPV 是由单个感染猫的FECV 通过突变演变而来的[18-22]，感染FECV 而无症状的猫，在恢复期与病毒再次感染的过程中，体内的FECV 发生突变，导致病毒毒力和组织嗜性增强从而形成FIPV，并能在单核细胞和巨噬细胞中持续复制[23]，被感染的细胞产生细胞因子、黏附分子和酶，导致典型的FIP 血管炎及血管周围病变[24]，继而形成化脓性肉芽肿并伴有浆膜炎、系统性炎症等病变。这可能是患猫肠管内病毒载量较高的原因。在Pedersen 等[25]的研究中发现，在已经确诊的FIP 病例中，存在眼部病变的比例占29%，多数为双侧眼睛病变。本研究从BJ-4病例中分离出的B5 毒株，验证了这一发现，提示人们通常低估了FIP 给眼睛造成的实际受损程度。

4 结论

本研究成功从FIP 阳性病料中分离到1 株FCoV BEJ5-2021（B5）。基于该毒株的F/S、S1/S2、CV、3c、7ab 蛋白编码基因进化分析可知，不同基因分型对应不同血清型和生物型，表明基因进化树同源性分析只能确定遗传进化关系。该分离毒株对猫肠、脾组织等有较强嗜性，而对胃、膀胱等组织嗜性较弱，同时眼睛也是病毒存在的器官之一。