人乳头瘤病毒多基因亚型与病毒载量同步检测在子宫颈病理诊断中的应用

张丽芳，欧阳小娟，余英豪，曲利娟，黄惠娟，王旭洲

女性生殖道黏膜人类乳头状瘤病毒(human papilloma virus, HPV)感染是最常见的与病毒相关性传播疾病，约80%女性50岁前发生过生殖道HPV感染[1]。然而，子宫颈病变及子宫颈癌早期常无明显症状，易忽视，必须行定期筛查才能早诊断、早治疗。目前研究表明，子宫颈癌的发生与高危型HPV感染密切相关[2]，且部分细胞学检查阴性患者亦存在高危型HPV(high-risk HPV, HR-HPV)感染，这些人群亦有发生子宫颈癌的风险。因此，合理有效的筛查方法显得尤为重要[3]。液基细胞学(liquid-based cytologic test, LCT)联合HPV多亚型分型与病毒载量检测方法能够灵敏检测HR-HPV感染，但HPV多亚型分型与病毒载量检测中高敏感性的引物序列错误扩增及高拷贝DNA可能导致非特异性表达。因此，探讨灵敏高效的子宫颈癌前病变诊断方法尤为重要。本研究旨在探讨LCT联合HPV多亚型分型与病毒载量及DNA浓度控制检测方法在子宫颈癌早期筛查中的应用价值。

1 材料与方法

1.1 材料选取2019年11月～2020年2月中国人民解放军联勤保障部队第九○○医院收治的子宫颈相关疾病患者1 247例，年龄19～60岁(平均40岁)。入选标准：(1)年龄19～60岁，有既往性生活史；(2)无严重自身免疫性疾病；(3)非孕期；(4)3天内无阴道冲洗和阴道用药史以及无性生活史。排除标准：(1)阴道或子宫颈存在感染性疾病或在月经周期；(2)确诊子宫颈病变；(3)检查具有盆腔包块或其他肿瘤；(4)已有子宫切除。LCT检测试剂(美国BD医疗公司)；HPV核酸分型检测试剂(杭州硕世生物公司)。

1.2 方法

1.2.1LCT检测 采集宫颈外口和颈管部位脱落细胞于载玻片上，用95%乙醇 ∶异丙醇(1 ∶1)固定，经巴氏染色、二甲苯透明、封固。显微镜下阅片，按TBS分类法作出病理诊断[4]。

1.2.2阴道镜病理检查 对LCT提示炎性抹片中有ASC-US，类似湿疣病变及其低级别鳞状上皮内病变(low-grade squamous intraepithelial lesion, LSIL)以上病变的369例患者，在阴道镜下对可疑部位进行活检。以组织病理学检查结果作为确诊标准。

1.2.3HPV多亚型分型与病毒载量检测 采用荧光定量PCR检测系统，HPV21分型与病毒载量检测(包括高危型：16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、68；中危型：26、53、66、73、82及低危型6、11、81)，按照各亚型扩增CT值测定HPV病毒载量。检测OD260/OD280比值介于1.8～2.0之间，采用DEPC水对提取DNA的浓度分成6个浓度范围分别为10、30、50、80、100、200 ng/mL进行倍比稀释，DNA浓度检测采用紫外分光光度仪检测。

2 结果

2.1 LCT细胞学检测本组1 247例患者中，无上皮内病变或恶性病变(negative for intraepithelial lesion or malignancy, NILM)[包括有意义不明确的非典型鳞状细胞(atypical squamous cells of undetermined significance, ASC-US)和念珠菌/滴虫感染]878例(70.40%)；炎性抹片有ASC-US，类似湿疣病变175例(14.03%)；LSIL/湿疣病变126例(10.10%)；HSIL/不排除鳞状细胞癌68例(5.45%)(图1)，各组差异无统计学意义(P>0.05)。

图1 LCT检测镜下分析：A.有ASC-US；B.炎性抹片中有ASC-US，类似湿疣病变；C.LSIL/湿疣病变；D.HSIL/不排除鳞状细胞癌

2.2 HPV多亚型分型与病毒载量检测与LCT比较1 247例患者HPV多亚型分型与病毒载量检测阳性446例(35.76%)，801例结果阴性，两组比较差异有统计学意义(P<0.05，表1、2)。

表1 LCT联合HPV多亚型分型与病毒载量检测高危型HPV病毒分析[n(%)]

2.3 LCT、HPV多亚型分型和病毒载量检测与阴道镜组织学诊断三种检测方法分析LCT联合HPV多亚型分型与病毒载量检测共同阳性244例，单独LCT检测阳性369例，符合率66.12%(244/369)；LCT联合HPV多亚型分型与病毒载量检测方法在炎性抹片有ASC-US及湿疣病变与组织学结果的符合率91.4%(85/93)；LCT联合HPV多亚型分型与病毒载量检测LSIL以上病变151例，与组织学结果比较，组织学诊断子宫颈上皮内病变(cervical intraepithelial neoplasia, CIN)1级、CIN 2/3级146例阳性，符合率96.7%(146/151)，低于HPV多亚型分型与病毒载量检测与LCT结果的阳性符合率98.01%(148/151)(表3、4)。

表2 LCT联合HPV多亚型分型与病毒载量检测灵敏度、特异度的比较分析

表3 LCT联合HPV多亚型分型与病毒载量检测与组织学结果对比

2.4 HPV病毒负荷载量与组织学检查对比将HPV病毒负荷载量分成4个阶段：1E2、1E3、1E4、1E5以上，发现检测病毒载量越高，子宫颈病变级别越高(表5)。

2.5 DNA浓度与HPV多亚型分型与病毒载量检测值的相关性检测扩增CT值在34.5～36.7，对应结果轻微炎症或无明显HPV病毒感染75.8%(25/33)，DNA浓度HPV载量检测值也相应变化，出现假阳性。将33例HPV载量扩增CT值在34.5～36.7之间的病例提取DNA浓度，分成10、30、50、80、100、200 ng/mL不同浓度，DNA浓度经过稀释控制后结果出现变化，33例HPV多亚型分型与病毒载量检测值1.56E3～5.78E3的病例DNA浓度控制在10、30、50 ng/mL时，检测未出现阳性(阴性测定值阈值≥36.7)，浓度为80、100、200 ng/mL时仍为阳性(表6)。

表4 不同子宫颈病变中HPV感染的情况[n(%)]

表5 HPV载量与组织学检查对比

表6 DNA浓度所对应的HPV多亚型分型与病毒载量检测值相应变化对比

3 讨论

子宫颈癌是目前可以预防和阻断的妇科恶性肿瘤，大量研究证实HPV感染是子宫颈癌发病的必要因素，有研究报道约82.4%的子宫颈癌前病变都存在HPV感染[4]。近年研究表明，高危型HPV持续感染是子宫颈癌发生的主要危险因素，高危型HPV已作为筛查CIN及子宫颈癌的重要标志应用于临床。高危型HPV阳性时，需进一步行细胞学或阴道镜检查；高危型HPV阴性时，子宫颈癌的发生率低，因此对这部分人群暂不需要进行阴道镜检查，避免过度检查[5]。本研究也显示，筛查人群中子宫颈上皮细胞异常的HPV多亚型分型与病毒载量同步检测的阳性率高达96.7%，HSIL为96.6%，LSIL为97%，表明高危型HPV检出率随着子宫颈病变严重程度显著增加。目前开展较多的LCT检查，其病理诊断结果与病理医师主观阅片相关，存在假阴性病例的因素[6]。本研究联合LCT和HPV多亚型分型与病毒载量同步检测对子宫颈病变进行诊断，其敏感性[91.4%(85/93)]较单独LCT结果的阳性符合率[43.9%(93/212)]明显提高。良性病变中部分HPV多亚型分型与病毒载量检测阳性，行LCT联合HPV多亚型分型与病毒载量同步检测筛查，将避免漏诊部分ASC-US及LSIL的HPV感染病例。实验结果表明细胞学及组织学诊断病变程度不断提升，HPV感染率显著上升，故对于HPV阳性且细胞学阴性的病例，根据细胞学+HPV联合检测结果异常处理流程，高危型HPV阳性病例应行阴道镜检查，其他型HPV阳性病例应缩短筛查间隔，重复细胞学和HPV检测，若持续HPV阳性，不管LCT是否阳性必须行阴道镜检查。

本研究以1 247例行LCT检测病例作为观察对象，LSIL以上157例，阴道镜下组织病理学检查，病理符合率100%；LCT联合HPV多亚型分型与病毒载量检测LSIL以上151例，与组织学结果比较符合率96.7%(146/151)，低于HPV多亚型分型检测与LCT共同阳性结果的符合率98.01%(148/151)，单独LCT检测明显低于LCT联合HPV多亚型分型与病毒载量同步检测的检出率[7-8]。

HPV检测筛查人群中高危型HPV感染率为446/1 247(35.80%)，在HSIL中HPV阳性率高达96.7%，本组与文献报道相符[9]，可见HPV阳性预示高级别鳞状上皮内病变存在或发展为高度病变，HPV检测高危型HPV病毒载量呈递增趋势，显示病毒载量与HPV多亚型分型检出例数成正比，随着高危型HPV的病毒载量不断增高，子宫颈病变程度提高，2例病理诊断子宫颈癌变的HPV多亚型分型检测高危型HPV均阳性，提示HPV多亚型分型方法的可靠性。但HPV多亚型分型方法也存在高灵敏性导致的非特异性表达，子宫颈样本内源性的非特异性RNA/DNA杂交体变性不完全污染以及高DNA浓度产生的非特异性杂交反应会产生假阳性。检测值在1.56E3～5.78E3时，对应的病理检测结果轻微炎症或无明显HPV病毒感染率为75.8%(25/33)，存在HPV假阳性情况，分析原因：(1)HPV多亚型分型方法过于敏感；(2)取材细胞量过多，提取DNA浓度过高。因此本实验采用HPV载量检测值在1.56E3～5.78E3的病例，提取DNA浓度范围分别为10、30、50、80、100、200 ng/mL，33例HPV多亚型分型病毒载量检测值在1.56E3～5.78E3的病例DNA浓度控制在10、30、50 ng/mL时，检测结果为阴性，浓度为80、100、200 ng/mL时结果仍为阳性。因此，LCT联合HPV多亚型分型与病毒载量检测，其灵敏性高、特异性强，但可能存在非特异性(假阳性)，必须对标本提取DNA浓度进行质量控制才能准确对初筛高危人群及时发现病变，阻断子宫颈病变进展，降低子宫颈癌的发病率和病死率。