肺癌中赖氨酰氧化酶样蛋白2的研究进展

普元倩，李 彬，余 敏，熊 伟

目前肺癌是全球第二大常见癌症，其发病率仅次于乳腺癌，病死率位居首位。2020年全球新增肺癌病例1 930万例(占癌症总例数的11.4%)，肺癌死亡人数近1 000万例(占癌症总死亡例数的18.0%)[1]。与大多数国家相比，我国肺癌的病死率相对较高，约占所有癌症死亡人数的20.0%，预计2015～2030年期间我国肺癌病死率可能会增加约40.0%，晚期肺癌患者的预后较差，5年生存率仅为19.7%，严重威胁人类健康[2]。深入认识肺癌的发病机制及分子机制，有助于肺癌预后指标和新治疗靶点的发现。赖氨酰氧化酶样蛋白2(lysyl oxidase-like protein 2, LOXL2)是一种铜依赖的胺氧化酶，定位于细胞质和细胞核，广泛存在于多种肿瘤组织和细胞中，参与调节肿瘤细胞的增殖、侵袭和转移等过程。因此，本文主要对LOXL2蛋白的结构、作用机制、在上皮-间质转化(epithelial-mesenchymal transition, EMT)和侵袭中的作用、在肺癌中的表达与预后价值以及LOXL2单克隆抗体和小分子抑制剂在肺癌中的治疗作用进行综述，进一步探讨LOXL2蛋白在肺癌中的应用前景。

1 赖氨酰氧化酶蛋白家族与LOXL2

赖氨酰氧化酶(lysyl oxidase, LOX)是一类铜依赖性胺氧化酶，具有催化胶原蛋白和弹性蛋白在细胞外基质共价交联的作用[3]。1997年，Saito等[4]从人成纤维细胞cDNA文库中分离的新cDNA(WS9-14)，编码一种结构类似LOX的蛋白质，其蛋白质包含4个富含半胱氨酸的清道夫受体结构域，这些结构域通常存在于一些分泌型或细胞表面蛋白质中，这提示LOX基因家族的存在。已有研究表明，LOX蛋白家族包括5个成员(图1)：LOX和LOXL1～4，各成员相对分子质量在5.0×104～9.3×104之间[5]。所有LOX蛋白结构均含有一个高度保守区域，位于C-末端，包含铜离子结合位点、赖氨酸酪氨酸酰醌残基(lysine tyrosylquinone, LTQ)和细胞因子受体样(cytokinereceptor-like, CRL)结构域，对其催化活性至关重要。另一个区域位于可变的N-末端，含有4个组氨酸，为铜结合部位，各种酶之间有部分修饰作用[6-7]。根据其N末端一级结构的差异，LOX蛋白分为两个亚家族，一个亚家族由LOX和LOXL1组成，另一个亚家族由LOXL2、LOXL3和LOXL4组成。LOX和LOXL1是以前体蛋白(pro LOX和pro LOXL1)的形式分泌的，这种前体蛋白可以进一步被肽酶水解成具有催化活性的活性蛋白和N末端的前肽区域[8]。LOX和LOXL1的前肽不包含半胱氨酸残基，LOXL1在N末端有一个富含脯氨酸的结构域。LOXL2～4的信号肽区域紧连一段含有4个富含半胱氨酸的清道夫受体(scavengerreceptorcysteine-rich receptor, SRCR)结构域，该结构域被认为参与了细胞外基质(extracellular matrix, ECM)和细胞表面蛋白质之间的相互作用[9-10]。研究发现，LOXL2的催化结构域与LOXL3、LOXL4的同源性分别为88%和86%。然而，LOXL2与LOX、LOXL1的同源性分别为68%和66%[5]。LOXL2是LOX家族中研究最广泛的成员，可能是癌症治疗的潜在新靶点。

图1 LOX蛋白家族的结构

2 LOXL2的作用机制

ECM为正常细胞提供结构和化学支持，从而调节各种细胞功能，如细胞黏附、信号通路、基因表达和迁移。胶原蛋白和弹性蛋白是ECM的主要结构蛋白质。从分子间交联开始，ECM逐渐组装形成一个与不同组织相容的功能网络。LOXL2作为细胞外酶参与细胞基质稳态的调节，催化ECM胶原和弹性蛋白中赖氨酸和羟基赖氨酸残基的氧化脱氨基，产生高活性醛和醛赖氨酸，可以与其他赖氨酸或醛赖氨酸残基形成分子间和分子内共价键，交联ECM。这在ECM网络的形成、修复和连接组织的构建中发挥重要作用[10-12]。

LOXL2发挥内源性作用的机制包括4个主要步骤：(1)来自ECM胶原(或弹性蛋白)中赖氨酸残基的侧链胺可逆地与LTQ结构域的羰基结合，形成Schifi碱。(2)一个质子被LOXL2结构中靠近LTQ的碱性残基取代。这种质子的取代是由LTQ区域内稳定的芳香环的形成所驱动的。(3)芳酰亚胺被水解，释放醛(烯赖氨酸)并产生氨基酚。(4)氨基酚与O2和Cu2+的反应使LTQ再生，从而催化进一步交联。氨和过氧化氢在这个过程中作为副产物被释放[13-14]。如果这一过程失调，可能会导致交联过量，这是导致纤维化发生的化学过程基础。此外，每一个反应循环均会产生过氧化氢，而过量的过氧化氢激活了已知参与肿瘤进展的信号通路[14]。

Barry-Hamilton等[15]的研究对人类肿瘤组织、肺纤维化和肝纤维化组织进行活组织检查，结果显示，与正常对照组织相比，LOXL2在疾病相关基质中表达增加。目前，在肿瘤转移中LOXL2是在细胞内、外或两者同时发挥作用尚未明确。赖氨酸残基脱氨基可以介导LOXL2在ECM胶原交联中的作用(图2)。首先，López-Jiménez等[16]研究表明，LOXL2在K317位点被丝氨酸蛋白酶在细胞外加工，产生缺乏前2个富含半胱氨酸的SRCR结构域的蛋白质，大小为6.5×104。阻止蛋白水解过程的位点特异性突变产生了一种全酶，该酶在体外对可溶性胶原底物具有活性，但不能交联ECM中不溶性胶原。其次，这种LOXL2蛋白在K317位点的翻译后修饰过程，在浸润性导管癌的组织提取物中也被证实可以通过前蛋白转化酶PACE4来完成。与需要裂解其前肽以发挥催化活性的LOX不同，LOXL2裂解对原弹性蛋白的氧化和Ⅳ型胶原的体外交联均不是必需的，而LOXL2需要经过前肽的裂解才能发挥催化活性[16]。LOXL2的加工处理使胶原交联程度增强大约2倍，LOX和LOXL2催化活性调节机制的重要差异，为进一步研究LOXL2在纤维化和肿瘤进展中的潜在差异功能奠定基础。

3 LOXL2在肿瘤细胞EMT和侵袭中的作用

LOXL2的异常表达已被证实可以促进乳腺癌和胃癌的转移[17]。将过表达LOXL2的MCF-7乳腺癌细胞接种到小鼠体内，其表现出更强的侵袭性，并在这些细胞中诱导EMT[18]。EMT是指上皮细胞向间质细胞转化的过程，细胞失去极性获得纤维细胞表型，该过程包括细胞间紧密连接和黏附连接蛋白(如E-cadherin、β-catenin)表达减少或重新分布，使细胞获得较强的侵袭和转移能力[19]。LOXL2在侵袭和转移中的作用已被广泛研究。除了其细胞外活性，Peinado等[20]研究表明，LOXL2还可以在癌细胞内发挥作用(图2)。细胞内LOXL2抑制转录因子Snail降解(参与EMT表型)，增加其表达量从而抑制E-cadherin基因(CDH1)的表达，控制EMT过程。此外，LOXL2还参与催化组蛋白H3第4位三甲基化赖氨酸(H3K4)的脱氨基作用。Herranz等[21]报道LOXL2的氧化作用使三甲基化的氨基被释放，将三甲基化赖氨酸(K4)转化为醛赖氨酸。这种相互作用也抑制了E-cadherin的活性，通过Snail蛋白依赖途径诱导EMT过程。

图2 LOXL2在癌症转移中的细胞内和细胞外信号通路

LOXL2还与癌症转移有关，过氧化氢产物促进FAK/Src通路中Src磷酸化水平上调[22]。FAK是一种细胞内酪氨酸激酶，通过细胞黏附的组装和分解被作为细胞迁移的启动子。激活的FAK召集Src家族成员募集到迁移细胞前缘的黏着点，形成复合物，使其他蛋白质进一步磷酸化，这是迁移中十分重要的过程。FAK/Src信号通路在乳腺癌模型中被证明是PI3K/Akt通路的上游信号成分，该通路与细胞增殖、致瘤性和细胞迁移有关。此外，由LOXL2酶活性产生的H2O2也会直接激活PI3K/Akt信号通路。LOXL2通过多种机制激活多个信号通路促进肿瘤进展，表明LOXL2蛋白可以作为预防肿瘤转移及治疗的新靶标[23]。

4 LOXL2在肺癌中的表达及其预后价值

目前，肺癌是癌症死亡的主要原因之一，非小细胞肺癌(non-small-cell lung cancer, NSCLC)约占肺癌的85%，并可根据细胞类型进一步区分为腺癌、鳞状细胞癌、大细胞癌和神经内分泌癌[24]。早期肺癌的治疗以手术切除为主，但多数患者在确诊时已为晚期，预后不良[24]。Zhan等[25]在Oncomine基因芯片数据库中检测到NSCLC和正常肺组织中LOXL2 mRNA存在差异表达，通过分析发现LOXL2 mRNA在NSCLC组织中的表达高于正常组织；进一步采用免疫组化法检测75对肺腺癌和匹配的邻近正常组织中LOXL2蛋白的表达水平和分布，结果显示LOXL2蛋白主要分布于细胞核和细胞质，75例肺腺癌组织中LOXL2蛋白水平亦高于配对的邻近正常组织。上述研究结果表明：LOXL2表达上调可能在肺癌的发展中起关键作用。此外，在腺癌和鳞状细胞癌亚群中，LOXL2表达增加与肿瘤大小和癌症分期呈正相关。在肺鳞状细胞癌细胞系中，沉默LOXL2基因可以抑制肿瘤细胞的迁移和侵袭[26]。

对NSCLC肿瘤进展相关机制的研究发现，内源性微小RNA(micro RNA, miRNA)直接参与LOXL2的表达。miRNAs是一种小分子非编码RNA，其与靶基因的3′UTR结合，通过序列特异性的方式抑制翻译或切割RNA转录物来调节蛋白质编码基因的表达[27]。大量研究表明，miRNAs在许多人类癌症中异常表达，并在人类肿瘤的发生和转移中发挥重要作用。在肺癌细胞和成纤维细胞中，LOXL2和SERPINH1受miR-29a的直接调控。Ye等[27]通过qRT-PCR和Western blot检测证实，miR-29a对EBC-1、A549和MRC-5细胞中LOXL2和SERPINH1的表达呈负调控。与EBC-1、A549和MRC-5中的模拟物或miRNA对照转染子相比，miR-29a转染子中LOXL2和SERPINH1的mRNA和蛋白表达水平被显著抑制；而抑制miR-29a表达导致这些细胞中LOXL2和SERPINH1的表达水平上调。研究表明，miR-29a在肺癌组织和特发性肺纤维化(idiopathic pulmonary fibrosis, IPF)病变中的表达显著降低，并且miR-29a过表达显著抑制肺癌细胞和成纤维细胞的增殖、迁移和侵袭。Kamikawaji等[28]研究显示，miR-504过表达抑制了NSCLC细胞的增殖、侵袭和EMT过程。上调miR-504后通过与NSCLC细胞中LOXL2 mRNA的3′UTR结合来抑制LOXL2的表达。LOXL2的异位表达逆转了miR-504过表达对NSCLC细胞增殖和侵袭的抑制作用。此外，LOXL2表达已被证实直接受miR-200/ZEB1轴诱导的EMT调控。ZEB1诱导LOXL2介导的胶原在细胞外基质中稳定和沉积，激活FAK/Src信号，从而驱动肺癌的侵袭和转移。然而，LOXL2过表达时没有观察到对肿瘤转移潜能的影响，说明单独的LOXL2不足以驱动转移，但对肿瘤微环境中的肿瘤生长是必需的。这表明LOXL2介导其他细胞信号分子的作用，而不是效应蛋白质[29]。

有研究在探讨LOXL2表达与肺癌临床病理特征的关系中发现，在临床分期较高或合并有显著的淋巴结转移肺癌患者中，LOXL2的表达水平均显著上升，提示LOXL2表达与肺癌临床病理特征密切相关，这主要是由于LOXL2表达上升能够提高癌细胞对于临近正常肺泡组织的浸润，导致癌细胞扩散和累及范围增加。危险因素分析研究也发现，TNM分期增高、发生淋巴结转移、LOXL2蛋白表达与患者的不良预后直接相关，进一步提示了LOXL2蛋白表达与肺癌患者临床预后的关系，临床上可以根据LOXL2蛋白表达情况进行患者的随访，进而评估肺癌患者的临床转归[30]。以上研究结果表明，LOXL2也可能成为NSCLC患者的一种新的预后生物标志物和干预肺癌进展转移的治疗靶点。

5 LOXL2单克隆抗体与小分子抑制剂在肺纤维化和肺癌中的治疗作用

近年来，针对抗LOXL2的单克隆抗体和选择性LOXL2小分子抑制剂的研究已经取得初步进展。目前已研发出抗LOXL2的单克隆治疗性抗体(AB0023)，可抑制LOXL2的活性，在原发性和转移性异种移植肺癌模型以及肺纤维化模型中均有效。抑制LOXL2后，可导致成纤维细胞活化、结缔组织增生、内皮细胞显著减少、生长因子和细胞因子的产生减少、转化生长因子-β(transforming growth factor-β, TGF-β)信号通路减少[31]。小分子抑制剂在抑制LOXL2的效果方面优于抗体，其分子小且更容易进入酶的活性部位，从而抑制酶的活性。β-氨基丙腈(β-Aminopropionitrile, BAPN)是LOX家族的小分子抑制剂，可竞争性地、不可逆地抑制LOX酶的催化结构域，这种催化结构域可以抑制LOXL2的活性，通常用于体外和体内研究。BAPN在各种疾病以及与LOX家族抑制相关的细胞过程中均有研究，在体外和体内均得到了证实[32]。BAPN可以使IPF中的胶原重塑恢复到基线水平。此外，在临床诊断为特发性肺动脉高压的患者供体血管中，LOX、LOXL2和LOXL3的表达水平较高。这些酶在小鼠体内的表达水平相似，LOX高表达可导致血管病变。BAPN并不影响肺成纤维细胞mRNA的稳态水平，因此BAPN只负责抑制LOX的酶活性。在另一项研究中，BAPN治疗使肺动脉高压的小鼠中LOX mRNA表达降低，因此，BAPN具有降低LOX mRNA表达水平和抑制酶活性的双重作用。据Ovet等[33]报道，铜螯合剂四硫钼酸盐(Tetrathiomolybdate, TM)可抑制小鼠肺纤维化中激活的LOX、LOXL1和LOXL2表达。此外，Pharmakea公司开发的选择性LOXL2抑制剂(PAT-1251)在临床前模型中表现出有效性，并已进入临床开发阶段[34-35]。Pharmaxis公司研发的选择性LOXL2抑制剂(PXS-4878A)已用于肺纤维化和肺癌的临床试验。LOXL2/LOXL3小分子抑制剂(PXS-5153A)也已用于纤维化的临床试验，LOX/LOXL2抑制剂PXS-S1在临床前肿瘤转移模型中表现出特异性[36]。北京百奥来博等多家生物公司生产的选择性LOXL2抑制剂(LOXL2-IN-1 hydrochloride)，IC50值为126 nM，目前仅用于科研实验。以上这些结果将有利于后续开展更全面的研究，以进一步了解LOXL2调控肿瘤微环境、促进肿瘤进展和转移的机制。通过LOXL2单克隆抗体或小分子抑制剂降低LOXL2基因表达可能是治疗肺癌的一种有效方法。

6 结语

LOXL2催化细胞外基质胶原与弹力蛋白交联，使其纤维化，通过调节细胞信号通路促进肿瘤进展。LOXL2是一个潜在可行的药物靶点，因为其在细胞内和细胞外均具有活性，也被认为在EMT的逆向间质-上皮转化(mesenchymal-epithelial transition, MET)中发挥重要作用。该过程在肿瘤转移和定植的最后阶段是必不可少的。因此，LOXL2单克隆抗体和LOXL2小分子抑制剂可以作为一种个性化的药物，有效地用于LOXL2高表达和其它治疗效果较差的肺癌患者。然而，在临床应用上仍存在诸多难题，如LOXL2抑制剂的毒副作用、疗效是否确切等。随着研究的深入，抑制LOXL2活性可能是一种治疗肺纤维化和肺癌的有效研究方向。