单心室心脏病相关miRNAs的生物信息学预测及分析

王 凯，李钟鸣，李岩松，刘先玲，丁胤彰，孙 燕，许 迪

单心室心脏病(single ventricle heart disease, SVHD)是一种由于胎儿时期心脏发育不全，只有一个功能性心室的先天性心脏病[1]。尽管当前内科和外科治疗都取得了长足的发展，但SVHD仍是婴儿期心血管死亡的主要病因，也是小儿先天性心脏病人群发病的重要原因[2]。一项包括584例SVHD的临床随访结果显示，患者1岁时存活或不需心脏移植的发生率仅68.7%[3]。SVHD易引起充血性心力衰竭，约50%合并心力衰竭的SVHD患者在出生后1个月内死亡，74%合并心力衰竭的SVHD患者在出生后6个月内死亡[4]。因此，了解SVHD的发病机制，寻找其潜在的治疗靶点具有重要意义。MicroRNAs(miRNAs)是一类非编码、高度保守的RNA分子，可降解mRNA或与其靶基因的3′非编码区结合，在转录后水平调节目的基因的表达[5-6]。近来研究表明，miRNA与SVHD的发生、发展相关[4,7]。然而，目前SVHD的发病机制仍然不明，并且有很多miRNA还未被发现。本研究通过检索GEO数据库筛选出SVHD差异表达的miRNA，并对其进行靶基因预测，从而构建miRNA-靶基因调控网络，通过对靶基因进行GO及KEGG富集分析，以期寻找SVHD分子水平的发病机制及新的可能的治疗靶点。

1 材料与方法

1.1 基因芯片信息通过GEO数据库(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/)获得基于GPL25134平台的GSE136547的芯片数据。GSE136547数据集包括48例SVHD患者和32例健康人。

1.2 SVHD中差异表达miRNA的筛选48例SVHD患者和32例健康对照中差异表达miRNA通过R语言的limma程序确定。筛选条件：P<0.05，|log fold change>1|。使用R语言绘制差异表达miRNA的火山图和热图。

1.3 miRNA靶基因预测通过miRWalk 3.0(http: //mirwalk.umm.uni-heidelberg.de/)数据库对差异表达的miRNA进行靶基因预测，其中预测结点为3′UTR，预测评分0.95。选取miRDB、TargetScan以及miRTarBase三个数据库的交集作为差异表达miRNA的靶基因。

1.4 miRNA-靶基因调控网络构建使用Cytoscape构建miRNA-靶基因调控网络[8]。miRNA和靶基因作为结点，两者之间的相互关系为连线。三角形代表miRNA，圆形代表靶基因。

1.5 miRNA靶基因GO和KEGG分析利用R语言的clusterprofiler对miRNA的靶基因进行GO生物学功能富集分析和KEGG信号通路富集分析[9]。GO生物学功能富集分析包括生物学过程(biological process, BP)、细胞组成(cellular component, CC)、分子功能(molecular function, MF)。P<0.05表示差异有统计学意义。

1.6 miRNA靶基因的蛋白互作网络(protein protein interaction network, PPI)分析及核心基因筛选通过string11.5(https: //www.string-db.org/)预测靶基因编码的蛋白质之间的关系并构建PPI，PPI评分设置为0.4。使用Cytoscape软件编辑PPI网络，并且通过CytoHubba插件根据结点数筛选出前10个基因为关键基因[10]。

2 结果

2.1 SVHD中差异表达miRNA的筛选SVHD组和正常组共筛选出9个差异表达的miRNA，其中8个miRNA上调，1个miRNA下调(表1)。R语言的pheatmap绘制差异表达miRNA的聚类分析热图，R语言绘制差异表达miRNA的火山图(图1)。

图1 A.SVHD中差异表达miRNA的火山图；B.SVHD中差异miRNA的热图：红色代表上调的miRNAs，绿色代表下调的miRNAs

表1 SVHD中差异表达的miRNA

2.2 miRNA靶基因的预测通过miRWalk 3.0预测差异表达miRNA的靶基因，取同时出现在miRDB、TargetScan以及miRTarBase三个数据库中的基因为靶基因，共预测到129个靶基因(表2)。

表2 SVHD中差异表达miRNA的靶基因

2.3 miRNA-靶基因调控网络通过Cytoscape软件构建miRNA-靶基因调控网络。调控网络中的miRNA包括hsa-miR-20a-5p、hsa-miR-18a-5p、hsa-miR-18b-5p、hsa-miR-96-5p；靶基因主要有TP53INP1、ATXN1、NHLRC3、VMA21、ESR1、PDE4D(图2)。

图2 SVHD的miRNA-靶基因调控网络：三角形代表miRNAs；圆形代表靶基因

2.4 miRNA靶基因GO和KEGG分析GO富集分析包括CC、BP以及MF三个部分。GO富集分析在BP中主要为DNA损伤检查点、对β淀粉样蛋白的细胞反应、对β淀粉样蛋白的反应、有丝分裂G1期DNA损伤检查点以及G1期DNA损伤检查点；在CC中主要有转录因子复合物以及RNA聚合酶Ⅱ转录因子复合物；在MF中主要有DNA结合转录激活因子活性、DNA结合转录激活因子活性和特异性RNA聚合酶Ⅱ、磷蛋白结合、磷酸化酪氨酸结合残基以及胰岛素样生长因子受体结合(图3)。KEGG富集分析显示靶基因主要富集在MAPK信号通路、PI3K-Akt信号通路、人T细胞白血病病毒1感染、人类巨细胞病毒感染以及癌症中的miRNA(图4)。

图3 SVHD中差异表达miRNA靶基因的GO富集分析：BP.生物学过程；CC.细胞组成；MF.分子功能

图4 SVHD中差异表达miRNA靶基因的KEGG通路分析

2.5 miRNA靶基因的PPI分析及核心基因筛选去除不相关的蛋白节点后，进行靶基因的PPI构建，PPI中共有67个节点，143条连线(图5A)。通过CytoHubba插件根据结点数筛选出前10个关键基因，依次为MAPK1、CREB1、VEGFA、ESR1、SMAD2、IGF1R、IGF1、IRS1、APP、CRK(图5B)。

图5 A.SVHD中差异表达miRNA靶基因的PPI分析；B.筛选出的前10个关键基因

3 讨论

SVHD是一种较为复杂及罕见的先天性心脏病，miRNA在SVHD的发生、发展中具有重要作用[7]。然而，SVHD发病的分子机制尚不明确，并且有很多与SVHD发病相关的miRNA尚未可知。因此，本组通过检索GEO数据库，筛选出SVHD差异表达的miRNA，构建miRNA-靶基因调控网络及PPI网络，发现了与SVHD发生相关的关键miRNA及其靶基因。

本研究选取了人的血液miRNA芯片，其中包括48例SVHD患者和32例健康人全血中的miRNA表达数据，结果发现：(1)通过比较两组miRNA的表达水平，共筛选出9个差异表达的miRNA，其中有8个miRNA上调，1个miRNA下调；(2)miRNA-靶基因调控网络中miRNA包括hsa-miR-20a-5p、hsa-miR-18a-5p、hsa-miR-18b-5p、hsa-miR-96-5p；(3)PPI中的关键基因为MAPK1、CREB1、VEGFA、ESR1、SMAD2、IGF1R、IGF1、IRS1、APP、CRK；(4)靶基因富集的通路主要是MAPK信号通路、PI3K-Akt信号通路、人T细胞白血病病毒1感染、人类巨细胞病毒感染以及癌症中的miRNA。

近年研究显示miR-20a过表达可以改善扩张型心肌病的左室收缩功能，主要表现为改善左室射血分数[11]。此外，hsa-miR-20a-5p亦与左室重构有关[12]。SVHD通常表现为左心室致密化不全，并伴有左室重构的发生[13]。hsa-miR-20a-5p可能参与SVHD心室重构的发展。SVHD的常见并发症为心功能不全[14]，而心肌纤维化、氧化应激与心功能不全的发生、发展有关[15]。hsa-miR-18a-5p可通过Notch2通路抑制心脏纤维化[16]。hsa-miR-96-5p与氧化应激相关[17]。hsa-miR-18a-5p与hsa-miR-20a-5p可能分别通过纤维化途径及氧化应激途径参与SVHD导致的心功能不全的发生。SVHD的疾病进程伴随心肌缺血、缺氧导致心肌细胞肥大，最终引起心功能不全，而hsa-miR-18a能够抑制心肌细胞肥大[18]。本研究中hsa-miR-18a表达上调，过表达的hsa-miR-18a可能抑制SVHD引起的心肌细胞肥大。

SVHD会引起心室容量负荷过重，长期心室容量负荷过重可导致心功能低下。研究显示，MAPK1是心肌收缩的关键因子，与心力衰竭发生相关[19-20]，故SVHD容量负荷过重可能首先引起MAPK1表达变化，MAPK1表达异常导致SVHD心力衰竭的发生。SVHD的常见病理生理为缺血缺氧，而缺血缺氧会引起心肌细胞增殖。CREB是一种细胞转录因子，可与cAMP反应元件的特定DNA序列结合以增加或减少靶基因的转录，并且增殖的心肌细胞中CREB1表达增加[21]。因此，CREB1可能参与SVHD发生、发展过程中的细胞增殖。2016年，Sandeep等[22]发现SVHD中VEGF的表达较正常人升高，表明VEGFA在疾病发展中发挥着重要作用。已有研究显示ESR1、SMAD2、IGF1R、IGF1及IRS1与左心室重构相关[23-26]，表明这些基因可能参与单心室心肌病的心室重构。目前尚无研究显示APP和CRK与SVHD或心室重构的关系，它们可能是潜在的靶点，需要进一步研究来明确其相关性。

KEGG功能富集显示靶基因主要富集在MAPK信号通路和PI3K-Akt信号通路。最近的研究显示，抑制MAPK信号通路磷酸化可改善氧化应激[27]，而SVHD的发生过程中伴随氧自由基的产生[28]。MAPK信号通路磷酸化激活氧化应激，从而导致SVHD的发生、发展。先前的研究表明MAPK信号通路及PI3K-Akt信号通路共同参与心室重构的发生、发展[29]。因此，MAPK与PI3K-Akt信号通路可能与SVHD的心室重构相关。

综上所述，本研究发现SVHD中差异表达的miRNA及关键靶基因，并初步分析了其相关信号通路，后续将收集病例进一步分析，为SVHD的诊治提供了新的研究思路及理论依据。