HR-HPV 载量和HR-HPV E6 或E7 mRNA在宫颈癌和癌前病变的表达和意义

王玲玲，吴宗丙，罗继敏，朱胜章，刘运麟

（1.黔南州人民医院病理科，贵州 黔南 550008；2.黔南州中医院病理科，贵州 黔南 550008）

宫颈癌（cervical cancer）是临床常见的恶性肿瘤之一，也是目前病因明确且可进行早期诊断和治疗的恶性肿瘤之一[1]。但是目前临床尚未形成统一的预防和筛查宫颈癌的标准，其漏诊、误诊率较高[2]。研究显示[3]，宫颈癌患者癌变组织中几乎都有人乳头状瘤病毒（HPV）的表达，并发现HPV 感染也是引起宫颈癌的重要因素。由此可见，HPV 感染可能是宫颈癌的启动因子，围绕HPV 开展相关生物学研究，了解基因表达情况，对宫颈癌癌前病变转化具有重要的价值[4]。E6 或E7 基因是HPV 主要致癌基因，其荷载量、表达水平等都被认为是癌变进展的重要生物学预警指标[5]。目前，临床关于HR-HPV 载量和HR-HPV E6 或E7 mRNA 在宫颈癌和癌前病变中表达情况的相关研究较少，其表达水平与宫颈癌的相关性还需要不断探索[6]。本研究结合2020 年5月-2021 年5 月在我院诊治的89 例HPV 持续感染患者的临床资料，探究HR-HPV 载量和HR-HPV E6 或E7 mRNA 在宫颈癌和癌前病变的表达和意义，现报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选取2020 年5 月-2021 年5 月在黔南州人民医院诊治的89 例HPV 持续感染患者为研究对象，年龄33～64 岁，平均年龄（46.12±2.93）岁。依据病理组织分为宫颈癌组（n=33）、宫颈上皮内瘤变（CIN）Ⅰ组（n=19）、CINⅡ组（n=17）、CINⅢ组（n=20），各组年龄比较，差异无统计学意义（P＞0.05），具有可比性。本研究经过医院伦理委员会批准，患者自愿参加本研究，并签署知情同意书。

1.2 纳入和排除标准 纳入标准：①均符合临床宫颈癌前病变CIN 和宫颈癌诊断标准[7]；②均经病理学诊断确诊[8]；③纳入患者均为女性。排除标准：①合并严重器质性疾病者；②合并恶性肿瘤、自身免疫学疾病；③HIV 阳性[9]；④合并子宫或宫颈切除史。

1.3 方法 各组患者分别进行HR-HPV 载量、HRHPV E6 或E7 mRNA 检测。

1.3.1 HR-HPV 载量 采用PCR 荧光法，应用PCR扩增仪（Genesy96T，天隆科技）和HR-HPV 核酸定量检测试剂盒，试剂盒均由上海生物科技有限公司提供，主要包括16、18、31、33、45、52、56、58 型。于月经后半周期进行取样，采用阴道窥器暴露宫颈阴道部，干棉球拭净宫颈口过多黏液、血液、分泌物，贴紧宫颈口，将刷头置于宫颈管，顺时针旋转3～5 圈，停留5 s 取出，取下刷头，浸泡于含液基细胞学保存液的瓶中送检[10]。所有操作严格按照说明书进行，依据HR-HPV 载量分组：低载量组：104～105copies/ml；中载量组：105～106copies/ml；高载量组：106～107copies/ml；超高载量组：＞107copies/ml[11]。

1.3.2 HR-HPV E6 或E7 mRNA 采用QuantiVirusTM便携式冷光仪和HR-HPV E6/E7 mRNA 检测试剂盒，试剂盒有北京生物有限公司提供，包括16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、66、68 共14 型。应用支链DNA 信号扩增法，先将样品离心5 min，去上清液，加入2 ml 双蒸水清洗，再次离心，去上清液，加入裂解液混匀，再加入蛋白酶K，65 ℃孵育1 h，留取上清，再经过布板、信号放大、添加底物等过程后[12]，采用冷光仪检测，得到光子数后经软件转化为mRNA 拷贝数。

1.4 观察指标 比较各组HR-HPV DNA 载量、HR-HPV E6 或E7 mRNA 检出阳性率和表达水平；分析不同HR-HPV 载量（低载量、中载量、高载量、超高载量）的不同类型宫颈病发生率以及不同宫颈病变与HR-HPV 载 量、HR-HPV E6 或E7 mRNA的 相关性。

1.4.1 CIN 分级[13]CINⅠ：轻度非典型增生，排列不整齐，但仍保持极性，异常增生细胞仅占上皮层1/3；CINⅡ：中度非典型增生，排列较紊乱，异常增生细胞占上皮层的2/3；CINⅢ：重度非典型增生，失去极性，异常增生细胞扩展至上皮层的2/3 以上。

1.4.2 检出阳性标准[14]HPV DNA：如果增长曲线不呈S 型或循环阈值（Ct）为空白，则判样品的HPV DNA 总含量小于检测下限，如果增长曲线呈S 型且Ct 值＜40，HPV DNA＞103copies/ml 为阳性；mRNA拷贝数≥1 copy/ml 为阳性。

1.5 统计学方法 采用统计软件包SPSS 21.0 版本对本研究的数据进行统计学处理，符合正态分布的计量资料采用（）表示，组间比较采用t检验；计数资料采用[n（%）]表示，组间比较采用χ2检验；使用Spearman 进行相关性分析，P＜0.05 表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组HR-HPV DNA 载量、HR-HPV E6 或E7 mRNA检出阳性率比较 各组HR-HPV DNA 阳性率均大于阴性率，宫颈癌组、CINⅡ组、CINⅢ组HR-HPV E6 或E7 mRNA 阳性率均大于阴性率，CINⅠ组阳性率小于阴性率，差异有统计学意义（P＜0.05）；CINⅡ组HR-HPV DNA 载量阳性率与HR-HPV E6 或E7 mRNA 比较，差异无统计学意义（P＞0.05）；宫颈癌组、CINⅢ组HR-HPV DNA 阳性率、HR-HPV E6 或E7 mRNA 阳性率均大于CINⅠ组、CINⅡ组，差异有统计学意义（P＜0.05），宫颈癌组HR-HPV DNA 阳性率、HR-HPV E6 或E7 mRNA 阳性率与CINⅢ组比较，差异无统计学意义（P＞0.05），CINⅡ组HR-HPV DNA 阳性率、HR-HPV E6 或E7 mRNA 阳性率大于CINⅠ组，差异有统计学意义（P＜0.05），见表1。

表1 各组HR-HPV DNA 载量、HR-HPV E6 或E7 mRNA 检出阳性率比较[n（%）]

2.2 各组HR-HPV DNA 载量、HR-HPV E6 或E7 mRNA 表达水平比较 宫颈癌组、CINⅡ组、CINⅢ组HR-HPV DNA 载量、HR-HPV E6 或E7 mRNA 水平均高于CINⅠ组，差异有统计学意义（P＜0.05）；宫颈癌组HR-HPV DNA 载量、HR-HPV E6 或E7 mRNA 水平与CIN Ⅲ组比较，差异无统计学意义（P＞0.05）；CINⅠ组HR-HPV DNA 载量水平与CINⅡ组比较，差异无统计学意义（P＞0.05），CINⅡ组HR-HPV E6 或E7 mRNA 水平高于CINⅠ组，差异有统计学意义（P＜0.05），见表2。

表2 各组HR-HPV DNA 载量、HR-HPV E6 或E7 mRNA 表达水平比较（）

表2 各组HR-HPV DNA 载量、HR-HPV E6 或E7 mRNA 表达水平比较（）

注：与CINⅠ组比较，*P＜0.05；与CINⅢ组比较，△P＞0.05；与CINⅡ组比较，**P＞0.05，△△P＜0.05

2.3 不同HR-HPV 载量的患者不同类型宫颈病变发生率比较 不同HR-HPV 载量的患者CINⅠ、CINⅡ、CINⅢ和宫颈癌的发生率比较，差异有统计学意义（P＜0.05），见表3。

表3 不同HR-HPV 载量的患者不同类型宫颈病变发生率比较[n（%）]

2.4 不同宫颈病变患者HR-HPV DNA 和HPV E6 或E7 mRNA的相关性 CINⅠ、CINⅡ患者中HPV E6或E7 mRNA 和HR-HPV DNA 均呈正相关（r=0.431、0.709，P=0.000、0.000），CIN Ⅲ与宫颈癌患者中HPV E6 或E7 mRNA 和HR-HPV DNA 无相关性（r=0.152、0.089，P=098、0.432）。

3 讨论

宫颈癌生物标志物多种多样，常规HPV 基因检测灵敏度高，可一定程度降低宫颈癌漏诊率[15]。但是由于HPV 感染的普遍性和自限性，导致HPV 分型鉴别特异度低，仅能提示感染，不能准备判断是否存在宫颈病变，更无法对其严重程度进行准确判断[16]。因此，临床缺乏前瞻性预判指标，可能会错过CIN到浸润癌的关键节点。E6 或E7 基因是HPV 主要致癌基因，HPV 感染后可将E6/E7 DNA 整合至宫颈上皮细胞基因，使其获得基因E6/E7 DNA，并进一步激活，通过宿主细胞转录出E6/E7 mRNA，进一步翻译为癌蛋白E6/E7 DNA[17]。因此，HR-HPV 载量和HR-HPV E6 或E7 mRNA 在宫颈癌和癌前病变的表达具有重要的价值。

本研究结果显示，各组HR-HPV DNA 阳性率均大于阴性率，宫颈癌、CINⅡ、CINⅢ各组HR-HPV E6 或E7 mRNA 阳性率均大于阴性率，CINⅠ组阳性率小于阴性率（P＜0.05），CINⅡ组HR-HPV DNA载量阳性率与HR-HPV E6 或E7 mRNA 基本一致（P＞0.05），提示在比CINⅠ高等级的宫颈上皮内瘤变患者中HR-HPV E6 或E7 mRNA 阳性率均大于阴性率。同时，各组HR-HPV DNA 阳性率均大于阴性率，但是CINⅡ组和CINⅠ组比较，差异无统计学意义（P＞0.05），进一步表明HR-HPV DNA 和HRHPV E6 或E7 mRNA 参与宫颈癌发展，与宫颈病变程度密切相关，但是HR-HPV DNA 和HR-HPV E6或E7 mRNA 载量与疾病程度有关。本研究结果还显示，宫颈癌组、CINⅢ组HR-HPV DNA 阳性率、HR-HPV E6 或E7 mRNA 阳性率均大于CINⅠ组、CINⅡ组（P＜0.05），宫颈癌组与CINⅢ组比较，差异无统计学意义（P＞0.05），但CINⅡ组大于CINⅠ组（P＜0.05），表明随着宫颈上皮内瘤变等级的升高，HR-HPV DNA、HR-HPV E6 或E7 mRNA 阳性率有升高的趋势，但是CINⅢ和宫颈癌差异不明显。因此，临床可通过检测HR-HPV DNA、HR-HPV E6 或E7 mRNA 阳性率对宫颈癌和癌前病变进行筛查，初步对宫颈病变进行分级。宫颈癌组、CINⅡ组、CINⅢ组HR-HPV DNA 载量、HR-HPV E6 或E7 mRNA水平均高于CINⅠ组（P＜0.05），宫颈癌组与CINⅢ组比较、CINⅠ组HR-HPV DNA 载量水平与CINⅡ组比较，差异均无统计学意义（P＞0.05），CINⅡ组HR-HPV E6 或E7 mRNA 水平高于CINⅠ组，差异有统计学意义（P＜0.05），表明HR-HPV DNA、HRHPV E6 或E7 mRNA 表达水平在不同疾病程度中的表达不同。但是在CINⅠ和CINⅡ之间存在的差异，而CINⅢ和宫颈癌之间差异不明显。分析认为可能由于CINⅢ患者的HR-HPV DNA、HR-HPV E6或E7 mRNA 已经处于较高水平表达，与宫颈癌存在较多的交叉重叠情况，从而差异分布不显著[18]。因此，临床可通过检测HR-HPV DNA、HR-HPV E6 或E7 mRNA 表达水平，来鉴别宫颈癌与癌前病变，为临床的预防和治疗提供参考依据。

本研究显示，不同HR-HPV 载量患者CINⅠ、CINⅡ、CINⅢ和宫颈癌的发生率比较，差异有统计学意义（P＜0.05），表明不同HR-HPV 载量的患者不同宫颈病变比例存在差异，其中超高载量的患者变化最为明显。分析认为可能是由于宫颈癌病毒载量相对较高，其变化趋势相对更显著[19]。此外，HPV E6或E7 mRNA 和HR-HPV DNA 间存一定的相关性，在CINⅠ、CINⅡ患者中，HPV E6 或E7 mRNA 与HR-HPV DNA 呈正相关，CINⅢ与宫颈癌患者中两者无相关性，该结论与吴萍等[20]的报道相似。因此，临床定量测定HPV E6 或E7 mRNA 和HR-HPV DNA，可一定程度提高宫颈病变的灵敏度，但是具体的诊断效能还需要进一步的临床研究证实。

综上所述，对于持续HPV 感染的患者，应动态监测HPV E6 或E7 mRNA 和HR-HPV DNA 水平；对于较高HPV 负荷的患者，通常提示高级别（CINⅡ以上）以及严重宫颈病变可能性增加，需要加强监测和随访，以最大化提高HPV 清除率，改善患者预后。