骨髓增生异常综合征进展过程中核心基因的生物信息学分析

丁宇斌，唐旭东

骨髓增生异常综合征(myelodysplastic syndrome, MDS)是一组恶性克隆性造血干细胞疾病，其特征为髓系造血细胞一系或多系发育异常、骨髓无效造血，有较高风险转化为急性髓系白血病[1]。本文根据生物信息学筛选MDS和正常骨髓中的差异表达基因(differential expressed genes, DEG)，分析DEG表达谱的功能特征和筛选核心(hub)基因，以期从分子水平探讨MDS疾病的发生和进展机制，为MDS的临床治疗提供指导。

1 材料与方法

1.1 数据来源和DEG的筛选在GEO数据库(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/)[2]搜索“myelodysplastic syndrome”芯片数据，物种选择“Homo sapiens”，研究类型选择“Expression profiling by array”，选择GSE19429基因表达谱数据。使用GEO在线分析工具GEO2R进行DEG分析，根据P<0.05且表达值增加或降低2倍以上进行DEG筛选，去除探针无对应基因者和重复基因。

1.2 DEG的GO功能和KEGG通路富集分析应用WebGestalt[3](http://www.webgestalt.org/)分别进行上调和下调DEG的GO功能和KEGG信号通路富集分析；并利用Hiplot平台(https://hiplot.com.cn/)将富集分析结果绘制成气泡图。

GO功能富集分析的具体设置如下：物种选择人类；分析方法选择ORA(over-representation analysis)；功能数据库选择geneontology，并选择生物学过程(biological process, BP)；参照集合(select reference set)选择蛋白编码基因组(genome protein-coding)。KEGG通路富集分析的具体设置如下：物种、分析方法选择同前；功能数据库选择通路(pathway)并选择KEGG；参照集合选择同前。

1.3 蛋白互作网络构建及功能模块分析使用STRING[4]version: 11.0(http://string-db.org)进行DEG编码蛋白和蛋白互作(protein-protein interaction, PPI)网络分析，物种选择人类，高级设置中默认网络类型为full STRING network，默认蛋白互作评分阈值设置为中等置信度(medium confidence, 0.400)并认为具有统计学意义，默认FDR为medium(0.05)。

将STRING分析结果导入Cytoscape[5](version 3.7.2)，并利用其插件MCODE(version 1.6.1)在PPI中构建功能模块，默认设置Degree Cutoff=2，Cluster Finding=haircut，Node Score Cutoff=0.2，K-Core=2，Max. Depth=100；对功能模块内基因进行GO功能的生物学过程富集分析和KEGG信号通路富集分析。

1.4 hub基因的筛选使用Cytoscape插件cytoHubba选择“Degree”计算得到degree值TOP10的基因，将其作为hub基因。

1.5 hub基因的验证使用ONCOMINE数据库[6](version 4.5)(https://www.oncomine.org/)验证筛选得到在MDS患者与正常人样本中hub基因的mRNA表达水平，分别检索hub基因并设置过滤条件(Analysis Type: CancervsNormal Analysis；Cancer Type: Leukemia)，调整P值<0.01，差异倍数(fold change)=2，gene rank=Top 10%，选择过滤结果中MDSvsNormal进行Meta分析，完成MDS样本中hub基因mRNA表达水平的验证。

2 结果

2.1 DEG筛选GSE19429中含183例MDS和17例健康者骨髓CD34+细胞的基因表达谱数据，经GEO2R分析获得33个上调DEG和98个下调DEG。

2.2 GO功能富集分析和KEGG信号通路富集分析根据GO功能富集分析结果，上调DEG的生物学过程显著富集于Ⅰ型干扰素(interferon, IFN)诱导的信号通路及细胞对微生物的防御反应(FDR<0.05，图1)；下调DEG的生物学过程显著富集于免疫应答、抗原受体介导的信号通路和B细胞活化(FDR<0.05，图2)。根据KEGG信号通路的富集分析结果，上调DEG未见显著富集；下调DEG显著富集于造血细胞分化和原发性免疫缺陷(FDR<0.05)。

图1 上调DEG的GO功能富集分析结果

图2 下调DEG的GO功能富集分析结果

2.3 PPI网络构建和功能模块分析使用STRING构建PPI网络，上调DEG的PPI网络由31个节点和11条边构成(P<0.001，图3)；下调DEG的PPI网络由90个节点和155条边构成(P<0.001)。上调DEG的显著功能模块由5个节点和10条边构成，5个节点(基因)分别为IFIT1、IFIT3、IFI27、IFITM1、IFI44L；下调DEG的显著功能模块由12个节点和53条边构成，12个节点(基因)分别为BLK、BLNK、RAG1、RAG2、EBF1、CD19、CD79B、IRF4、PAX5、IGLL1、DNTT、VPREB1。

图3 上调DEG的PPI网络

根据GO功能的生物学过程富集分析结果，上调DEG的显著功能模块内基因富集于IFN-β信号通路和Ⅰ型IFN介导的细胞反应(FDR<0.05)；下调DEG的显著功能模块富集于B细胞受体信号通路、B细胞分化和抗原受体介导信号通路(FDR<0.05)。根据KEGG信号通路的富集分析结果，上调DEG的显著功能模块内基因未发现富集的KEGG信号通路；下调DEG的显著功能模块富集于原发性免疫缺陷通路和B细胞受体信号通路(FDR<0.05)。

2.4 hub基因的筛选结果上调的hub基因仅5个，分别为IFI44L、IFIT3、IFIT1、IFITM1、IFI27；下调的hub基因TOP10分别为CD19、PAX5、RAG1、CD79B、CXCR4、IRF4、VPREB1、EBF1、RAG2、IGLL1。

2.5 hub基因在mRNA表达水平的验证MDS与正常样本相比，CD19、RAG1、CD79B、CXCR4、IRF4、VPREB1、EBF1、IGLL1的mRNA表达水平显著下调(P<0.01，图4)；IFITM1和RAG2未能进行多数据集Meta分析，但单数据集验证IFITM1 mRNA表达水平在MDS中高于正常样本(P<0.01)，RAG2 mRNA表达水平在MDS中低于正常样本(P<0.01)。IFI44L、IFIT3、IFIT1、IFI27、PAX5的mRNA表达水平差异无显著性(P>0.05)。

图4 利用ONCOMINE数据库验证hub基因mRNA表达水平的Meta分析

3 讨论

目前认为MDS可能存在免疫妥协的病理机制，外周血中浆细胞样树突状细胞分泌IFN相对不足[7]，自然杀伤细胞减少且功能降低[8]，而髓源性抑制细胞数量增加且功能亢进，抑制T细胞的增殖和功能[9-10]，高危MDS患者的调节性T细胞功能亢进[11]，负性调控机体免疫反应。本研究中GO和KEGG富集分析结果一致表明MDS可能存在免疫缺陷和免疫耐受。IFITM1是IFN刺激诱导后分泌的蛋白，能够抑制病毒融合和释放入胞。IFITM1在乳腺癌、结直肠癌、非小细胞肺癌等多种肿瘤中高表达，可能与肿瘤进展相关[12-14]。IFITM1在MDS中表达显著上调可能是对Ⅰ型IFN分泌不足的一种细胞代偿性反应。

CD19是B淋巴细胞表面抗原，能够调控B细胞的发育分化和活化；B细胞抗原受体是B细胞膜表面免疫球蛋白，需CD79A和CD79B辅助完成抗原刺激信号向细胞内的传导，肿瘤浸润B淋巴细胞在肿瘤免疫中可能发挥着积极作用[15-16]。CD19和CD79B可能在MDS中低表达，即B淋巴细胞的免疫作用可能受到抑制，宿主免疫应答低下可能是MDS恶性克隆、免疫逃逸和MDS疾病进展的重要机制之一。

IRF4在B细胞的发育分化和淋巴细胞的增殖活化中起重要作用[17-18]，敲除IRF4后，小鼠活化的淋巴细胞和浆细胞数量明显减少，血清免疫球蛋白水平显著下降，T淋巴细胞的细胞毒作用或抗肿瘤作用减弱。IRF4可能在MDS中低表达，并导致机体的体液免疫和细胞免疫受到抑制。VPREB1选择性表达于B细胞发育的早期阶段，所编码的替代轻链(surrogate light chain, SLC)与Igα/Igβ(CD79A/B)异源二聚体参与前B细胞受体复合物的组成，在B细胞的阴性选择中具有关键作用[19]。SLC缺失后，分泌自身抗体的B细胞在阴性选择中可逃逸，血清中自身抗体的异常升高可能参与了多种自身免疫疾病的发病过程[20]。本研究结果表明：VPREB1和CD79B可能在MDS中低表达，提示MDS可能存在B细胞发育异常且分泌自身抗体的B细胞从阴性选择中逃逸，引起MDS的免疫紊乱[21]。

综上所述，在MDS中可能存在抗原受体介导的信号通路和B细胞活化等免疫应答过程受抑制，因此低～中危MDS的治疗可能需要增强免疫以抑制恶性克隆[22]，而非免疫抑制[23]。MDS在髓系细胞发育异常的同时可能存在B淋巴细胞发育异常，有助于从免疫表型特征上完善MDS的骨髓病理诊断[24]。增强肿瘤免疫在MDS的临床治疗中具有研究前景，值得进一步探索。