葛根开花习性观察及不同花期花粉活力的相关分析

莫周美，张秀芬，李恒锐，刘连军，吴玲玲，贺 鹏，韦婉羚

(广西农业科学院广西南亚热带农业科学研究所，广西 龙州 532415)

【研究意义】葛根[Puerarialobata(Willd.) Ohwi]为豆科蝶形花亚科的蔓生性多年生药食两用植物，在我国大部分省(区)均有分布，享有“亚洲人参”佳誉[1-2]，可研制加工成各种功能性保健食品和药膳食品，市场前景十分广阔[3-5]。目前我国已选育出“湘葛系列”“赣葛系列”“宋葛系列”“横峰系列”‘恩葛-08’‘桂葛1号’和‘桂粉葛1号’等多个葛根优良品种[2]，葛根产业得到了快速发展。杂交育种是品种更新的重要手段，而花粉活力直接影响葛根杂交育种成功率。但至今关于葛根杂交育种及开花习性方面的研究报道不多。因此，观察了解葛根的开花习性，分析其花粉活力，确定其花粉的最适宜利用时期，对葛根的有性繁育、杂交育种及葛根产业的可持续发展具有重要意义。【前人研究进展】孙奇[6]研究表明，花性器官的发生与分化由植物内在的遗传物质、内源激素及其外在环境条件共同决定。李海贤等[7]研究认为，选择最佳杂交授粉时间有利于提高植物育种成功率。方贯娜等[8]研究影响豇豆杂交结荚率发现，选择最佳去雄时间和授粉时间可明显提高豇豆结荚率。张玉梅等[9]研究菜用大豆杂交授粉方法，发现上午去雄后立即授粉不利于花粉杂交成活，而在前一天下午先去雄次日上午再授粉，有利于提高花粉的杂交成活率。陈忠文等[10]研究豆薯开花习性发现，豆薯在花的旗瓣未开展前已经完成授粉过程。王月异等[11]的研究结果显示，在苜蓿单花旗瓣展开而翼瓣未伸出花萼时雄蕊未散粉，此时进行授粉效率较高，可以增加授粉的可信度。杨小丹等[12]研究表明，兰花花粉活力越高其杂交授粉成功率越高，反之则越低。国内外对葛花的研究主要集中在化学成分和药用机理方面。戴雨霖等[13]研究发现，葛花中有30多种黄酮类化合物，黄酮类物质是葛花的重要成分且含量较高。裴妙荣和丁海琪[14]从葛花中分离出7-甲氧基香豆素。张杰等[15]从葛花中分离出黄豆黄苷等多种化合物。葛花因具有解酒护肝作用而备受青睐，市场上已有以葛花为主药的葛根饮料和葛根口服液等多种解酒产品出售[16]。杜鹏等[17]以葛根、葛花为主要原料研究出解酒酸乳饮料并经动物验证具有解酒功效。郭志芳等[18]研究出主要原料为葛花、具有醒酒功效的葛根咀嚼片。裴香萍等[19]、马奋刚等[20]对葛花的药材性状、显微特征和理化性质进行了研究。郭坤元等[21]开展恩施地区葛根花粉活力研究，发现低温储藏条件有利于延长葛根花粉活力的保持时间；花粉萌发率受蔗糖浓度、硼酸浓度和氯化钙浓度影响，在自然光和黑暗条件下，葛根花粉萌发率和花粉管的生长一致性无明显差异。【本研究切入点】目前，针对葛根化学成分分析及药用机理的研究较多，但关于葛花开花习性和花粉活力方面的研究鲜见报道。【拟解决的关键问题】在广西龙州县观察葛根开花习性，检测其不同开花期的花粉活力，了解葛花的生理特性，以期为葛根的杂交育种提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

试验于2020年4—12月在广西南亚热带农业科学研究所葛根种植基地(东经106°49′，北纬22°33′)进行，供试葛根品种为移栽的野生粉葛(扦插苗)。

1.2 试验方法

1.2.1 试验设计 2020年4月15日种植，正常大田水肥管理。每个品种种植80株，行距1.5 m，株距0.6 m，面积为72.0 m2。

1.2.2 开花习性观察 葛根花序形成后每天系统观察花蕾发育进程。参考陈忠文等[10]的方法划分花蕾发育时期(闭萼期、露瓣期、半伸期、始开期、半开期和盛开期)。参考张静等[22]的方法将葛根花期划分为初花期、盛花期和末花期，其中，约5%花序花朵开放记为初花期，约50%花序花朵开放时记为盛花期，约95%花序花朵凋谢记为末花期。参考李海贤等[7]、林立等[23]的方法，在葛根盛花期标记10个即将开放的花序，连续观察并记录开花进程。

1.2.3 花粉活力测定 在葛花盛花期，分别采集半伸期、始开期、半开期和盛开期的花朵，置于装有少量清洁水的自封袋，快速带回实验室，参考陈忠文等[24]、郝丽红等[25]的TTC染色法和I2-KI染色法测定花粉活力。其中，TTC染色法染色的花粉粒呈红色表示具有较强生活力，花粉粒呈淡红色表示活力微弱，无色为无活力；I2-KI染色法染色的花粉粒呈蓝黑色表示具有较强生活力，花粉粒呈淡蓝色表示活力微弱，花粉粒呈黄褐色和无色为无活力。

TTC染色法的花粉活力(%)= (染红花粉数/视野中花粉数) ×100

I2-KI染色法的花粉活力(%)= (染蓝花粉数/视野中花粉数) ×100

1.2.4 花粉萌发试验 参考郭坤元等[21]的方法开展花粉萌发试验。根据1.2.3中的花粉活力测定结果，选用盛花期中花粉活力最强一期的花粉开展花粉萌发试验。花粉萌发培养基为0.1%硼酸+0.1%氯化钙+不同浓度蔗糖。在双孔凹型玻片孔内分别滴入蔗糖浓度为5%、10%、15%和20%的培养基溶液，采集中午11：00—13：00的花粉，将适量花粉轻缓抖落至培养基上，将载玻片水平置于铺有湿润滤纸的培养皿中，室温(约28 ℃)培养45 min，重复3次。用NiKon-SMZ1270显微镜观察花粉的萌发情况，每个载玻片随机选取3个不重复的视野，统计萌发率(以花粉管长度大于花粉直径视为花粉萌发)。花粉萌发率(%)=萌发的花粉数/检测的花粉总数×100。

1.3 统计分析

试验数据采用Excel 2007进行统计，以SPSS 20.0进行差异显著性分析和相关分析。

2 结果与分析

2.1 葛根的开花习性

观察发现，供试野生粉葛花期在10月16日至11月5日，其中，10月16—19日为初花期，10月20日至11月1日为盛花期，11月2—5日为末花期，整个花期约21 d；花序为总状花序，长度在9.6～42.4 cm，每个花序有小花9～72朵，自下向上开放，每朵小花开放2～3 d，每个花序开放5～9 d；花序开花高峰期在初花后2～3 d，其中盛开期在15：00—15：40；开花的起止时间和开花数量受天气状况影响，天气晴朗、温度较高时开花早，而阴雨天、温度较低时开花推迟(表1)。

表1 葛根开花习性调查

从图1可看出，葛花花蕾发育各时期表现为：闭萼期花瓣全部包埋在花萼中，花萼紧闭(图1-A)；露瓣期花瓣刚从萼裂中露出，但长度未超过萼片(图1-B)；半伸期花瓣长度明显超过花萼(图1-C)；始开期旗瓣上部开始分开，龙骨瓣微露，花蕾长度达最大值(图1-D)；半开期旗瓣平展张开，翼瓣微张开(图1-E)；盛开期小花盛开，旗瓣大于90°向上翻转，顶端裂开，翼瓣对称张开，龙骨瓣露出(图1-F)。其中，闭萼期发育较缓慢，从花蕾形成到闭萼后期约14 d，颜色从黄绿色到基部微紫色再到基部往上2/3以上呈深紫色；露瓣期至半伸期发育快速，约1 d；半伸期至始开期需16～18 h，到盛开期仅需18～20 h。

A：闭萼期；B：露瓣期；C：半伸期；D：始开期；E：半开期；F：盛开期A：Calyx closed period；B：Dew petals period；C：Half stretch period；D：Presentation period；E：Half period；F：Blooming period图1 葛根花不同发育时期的外部形态Fig.1 External form at different developmental stages of P.lobata flowers

2.2 葛花花粉活力检测结果

2.2.1 不同检测方法检测的花粉活力 由表2可知，在葛根各开花期，TTC染色法测定的花粉活力均显著低于I2-KI染色法(P<0.05，下同)，其中，TTC染色法测定的半伸期花粉活力仅18.8%，而I2-KI染色法的测定结果为82.1%；TTC染色法测定始开期、半开期和盛开期的花粉活力分别为26.1%、24.8%和22.9%，而I2-KI染色法的测定结果分别为95.3%、93.5%和92.7%。在显微镜下观察染色情况，结果发现TTC染色法的花粉粒着色较困难，且颜色较淡，不易辨别(图2-A)，而I2-KI染色法染色迅速，着色明显且容易区分(图2-B)。可见，I2-KI染色法更适宜用于进行葛根花粉活力检测。

表2 葛根花蕾不同发育期的花粉活力检测结果

T：TTC染色法染色效果；I：I2-KI染色法染色效果T：Effect of TTC staining；I：Effect of I2-KI staining method图2 葛根花粉不同染色方法的染色效果比较Fig.2 Pollen dyeing effect of different methods on P.lobata

2.2.2 同一检测方法不同花蕾发育期的花粉活力 从表2和图3可看出，葛根花蕾不同发育期的花粉活力存在明显差异。其中，花蕾处于半伸期时其花药的花粉囊未散粉(图3-A)，I2-KI染色法检测的花粉活力为82.1%，显著低于其他3个时期(表2)；始开期时大部分花药已散粉，量大且将柱头包裹(图3-B)，此时花粉活力最强，I2-KI染色法检测的花粉活力达95.3%，但与半开期和盛开期无显著差异(表2)；半开期时花药已全部散粉，花粉量仍然较大(图3-C)，I2-KI染色法检测的花粉活力为93.5%；盛开期时I2-KI染色法检测的花粉活力为92.7%，低于半开期，但差异不显著(表2)。可见，葛花在半开期至盛开期的花粉量及花粉活力均保持在较高水平，说明这些时期葛花的花粉较适宜用于开展杂交育种。

A：半伸期花蕊；B：始开期花蕊；C：半开期花蕊；D：盛开期花蕊A：Stamens of half stretch period；B：Stamens of presentation period；C：Stamens of half period；D：Stamens of blooming period图3 葛根花蕾不同发育期的花蕊散粉情况Fig.3 Situation of stamen powder in different development stages of P.lobata

2.3 葛根花粉萌发试验结果

由表3可知，葛根花粉在蔗糖浓度为15%的培养基中发芽率最高，为36.23%，显著高于其他3个蔗糖浓度处理；在蔗糖浓度为10%的培养基中发芽率为12.49%，在蔗糖浓度为20%的培养基中发芽率为28.75%，二者差异显著；而在蔗糖浓度为5%培养基中的发芽率最低，仅1.86%，且显著低于其他3个蔗糖浓度处理。可见，葛根花粉在不同蔗糖浓度培养基中的发芽率虽然不高，但以含15%蔗糖的培养基最有利于葛根花粉萌发。

表3 不同蔗糖浓度对葛根花粉发芽的影响

2.4 不同花期花粉活力的相关分析

I2-KI染色法更适宜用于葛根花粉活力检测，因此以I2-KI染色法测定的半伸期(X1)、始开期(X2)、半开期(X3)和盛开期(X4)4个花期的花粉活力值进行相关分析，相关系数列于表4。由表4可知，葛根不同花期的花粉活力存在一定程度的相互影响，但4个花期花粉活力间的相关性均不显著(P>0.05，下同)。其中，半伸期花粉活力与始开期和半开期花粉活力均呈负相关，相关系数分别为-0.21和-0.11；半伸期花粉活力与盛开期花粉活力呈正相关，相关系数为0.97；始开期花粉活力与半开期花粉活力呈负相关，相关系数为-0.95；始开期花粉活力与盛开期花粉活力呈正相关，相关系数为0.02；半开期花粉活力与盛开期花粉活力呈负相关，相关系数为-0.33。

表4 不同花期花粉活力的相关分析结果

3 讨 论

植物花的形态特征和传粉模式是反映植物有性繁殖的重要依据[26-29]。本研究发现，在广西龙州县，葛根的花期在10—11月，与纪宝玉等[30]观察发现葛根花期在9月的结果不一致，可能与葛根品种(系)和地域环境等不同有关，但开花持续时间约21 d与纪宝玉等[30]观察到的葛根开花持续时间一致；葛根的每朵小花持续开放2～3 d，一个花序持续开放5～9 d，花序开放的盛花期在初花后2～3 d，小花盛开时间在15：00—15：40，这些开花习性目前未见报道。

本研究参考陈忠文等[10]对豆薯、李海贤等[7]对扁蓿豆开花习性的研究方法，将葛根花蕾的发育时期划分为闭萼期、露瓣期、半伸期、始开期、半开期和盛开期6个阶段。其中，半伸期时花药的花粉囊未散粉，到始开期时大部分花药散粉将柱头包裹；始开期至盛开期时花粉颜色发生变化，由金黄色变为淡黄色再变为灰黄色。本研究取样时发现半伸期葛花的花粉囊虽未散粉，但部分花药已与柱头高度持平，且经过检测花粉活力已较强，虽然认为进行葛根杂交育种时在半伸期去雄较合适，但半伸期至始开期厉时16～18 h，具体在半伸期的哪个阶段进行去雄最佳还有待进一步探究。

染色法是快速检测花粉活力的常用方法[31]。周英等[32]、王刚等[33]研究认为，染色法仅能检验花粉的活力，实践上还需开展花粉萌发试验和授粉试验，在三者的试验结果一致或呈正相关时，染色法才能在葛根育种中发挥作用。本研究发现，TTC染色法对葛根花粉的染色效果不佳，花粉着色较困难，且颜色深浅差异不明显，不易辨别，可能与材料选择有关；I2-KI染色法检测的葛根花粉活力较强，且染色时间短、效果明显，因此认为I2-KI染色法更适合用于葛根花粉活力检测，与陈忠文等[24]对豆薯花粉活力的检测结果一致，表明葛根花粉中的淀粉含量可能较高，I2-KI更容易使其花粉粒染色[34]；对不同花期的花粉活力及相关性进行分析，结果表明4个花期的花粉活力间无显著相关性，可能与这几个时期的花粉活力均保持在较高水平且葛花的花粉量均较多有关。

蔗糖在花粉离体培养中主要发挥提供能源和调节渗透压的作用[35]，硼元素是植物体内的微量营养生长调节剂，对糖分的吸收具有促进作用，且可促进花粉管壁形成进而加快花粉萌发生长[36]，Ca2+的动态变化对启动花粉萌发、调节花粉管伸长等环节也具有重要作用[37]。本研究在固定硼酸浓度和Ca2+(氯化钙)浓度基础上仅开展不同蔗糖浓度对葛根花粉萌发影响试验，结果发现，在含15%蔗糖培养基中的葛根花粉萌发率显著高于其他蔗糖浓度培养基，说明适宜蔗糖浓度的培养基对葛根花粉离体萌发具有一定促进作用；选择始开期时的花粉(I2-KI染色法检测结果此时花粉活力最强)进行花粉萌发试验，但葛根花粉在含不同浓度蔗糖培养基中的萌发率均较低，最高只有36.23%，与郭坤元等[21]对葛根花粉的萌发试验结果差异明显，是否因葛根品种不同或环境气候等因素不同而引起，还需进一步探究。

坐果率是制约植物杂交制种产量和授粉效率的重要因素。陈卫国等[38]研究辣椒杂交授粉时发现，坐果率易受多个因素如种苗质量和授粉植株的营养状况影响，采取培育壮苗、增施基肥、协调植株营养与生殖生长平衡、科学栽培管理等措施可提高坐果率。本研究观察发现，葛根在谢花时花朵全部掉落，无一坐果，直接导致授粉试验失败。因此，葛根坐果率低是品种问题还是受环境气候、栽培管理条件影响，有待在下一步工作中深入探讨。

4 结 论

I2-KI染色法可快速检测葛根花粉活力。葛根花粉活力在花蕾始开期至盛开期均维持在较高水平，可根据天气状况选取其中合适时期的花粉进行杂交授粉，从而提高葛根杂交成功率。