马铃薯组织中SGAs含量差异及其基因表达分析

李红艳，李洁雅，叶广继，2，3，4，5，苏 旺，2，3，4，5，周 云，2，3，4，5，王 舰，2，3，4，5

(1.青海大学，西宁 810016；2.青海省农林科学院，西宁 810016；3.青海大学青藏高原生物技术教育部重点实验室，西宁 810016；4.青海省马铃薯育种重点实验室，西宁 810016；5.省部共建三江源生态与高原农牧业国家重点实验室，西宁 810016)

【研究意义】糖苷生物碱(Steroidal glycoalkaloids，SGAs)是一类重要的植物次生代谢产物，主要存在于茄科和百合科植物中[1-2]。马铃薯栽培种含有50多种SGAs，95%以上是α-茄碱和α-卡茄碱[3-5]。马铃薯块茎中，SGAs主要分布在1.5 mm厚的皮层下[6]。全球种植5000多个马铃薯品种，因品种及贮藏方式不同，各个马铃薯之间SGAs含量差异较大[7]。马铃薯中SGAs含量在20 mg/100 g(鲜质量)、1 mg/g(干质量)范围内可以安全食用，达到20 mg/100 g会引起中毒，高于30～60 mg/100 g则会致死[8-11]。SGAs不仅对植物具有一定的防御作用，而且它能抑制人体内胆碱酯酶的活性[12-15]。研究发现，SGAs具有抗癌、抗炎、抗菌等药理活性，其中α-卡茄碱的药理活性是α-茄碱的2倍[16-19]。但马铃薯中SGAs含量过多，其毒性会破坏人体细胞膜结构，危害正常的中枢神经系统，影响马铃薯的安全食用和生产加工。【前人研究进展】关于马铃薯中SGAs的研究已有许多报道，Li等[20]研究发现，樟脑可抑制马铃薯块茎的发芽，从而降低SGAs的积累，孟卫芹等[21]研究发现，通风、低氧等条件下可延迟马铃薯发芽，使SGAs积累减少，霍权恭等[22]研究发现，马铃薯贮藏时间越长，SGAs积累越多。SGAs来源于胆固醇，胆固醇经过多次羟基化、氧化和转胺化反应，最终生成α-茄碱和α-卡茄碱[23]。马铃薯茎和块茎等生长旺盛的组织中容易合成SGAs，其生物合成分为萜类、甾醇类与茄啶三个阶段，合成过程中所需要的关键结构基因(如StSGT和StSSR2等)已有研究报道[24-26]。马铃薯作为主粮作物，其块茎不仅供人类食用，也可用于薯片、薯条等加工。目前，国内在选育马铃薯品种时对产量、抗病性、淀粉含量等性状关注较多，但是块茎中SGAs含量缺乏系统的检测及评价，可能是因为SGAs的检测需要专业设备和人力物力。【本研究切入点】随着主粮化的进程，我国马铃薯人均消费量将增加，马铃薯的食用安全需得到保障。储藏条件会使马铃薯块茎的品质发生较大改变，例如低温糖化、变绿发芽都会影响马铃薯产业的健康发展。【拟解决的关键问题】选育块茎中低SGAs含量的马铃薯是今后育种的主要方向之一，而且SGAs具有药理活性，马铃薯芽中SGAs含量高，部分马铃薯资源块茎长期储藏后SGAs含量增加，无法食用，均可作为提取SGAs的原料，为马铃薯的综合利用提供新思路以及为马铃薯的安全食用提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

马铃薯资源1-76、6-36、5-36、6-1来自青海省农林科学院生物技术研究所。

1.2 方法

1.2.1 标准溶液的配制 将α-茄碱和α-卡茄碱标准品用40%的甲醇水溶液(含0.1%甲酸)配制成400 ng/mL的标准中间液，再分别将标准中间液用40%的甲醇逐步稀释成4 μg/mL的混合标准工作液，取适量混合标准工作液用40%甲醇逐级稀释成浓度为25、50、100、200、300、400、500、600 ng/mL的混合液，过0.22 μm滤膜后，4 ℃冰箱保存备用。

1.2.2 样品处理 取地窖贮藏60 d的紫皮马铃薯资源(1-76、6-36)和白皮马铃薯资源(5-36、6-1)的块茎，光照60 d后的发芽马铃薯芽冷冻干燥后研磨。分别称取块茎和芽样品粉末0.2 g，加入5%的乙酸5 mL，涡旋混匀后超声处理30 min，8000 r/min离心5 min后收集上清液，上清液用40%的甲醇稀释50或500倍，过0.22 μm滤膜，待测。

使用美国Agilent公司生产的Agilent 1260 InifityⅡ-Agilent 6470高效液相色谱—串联质谱仪检测α-茄碱和α-卡茄碱含量。α-茄碱和α-卡茄碱标准品购自美国Sigma公司。

1.3 SGAs生物合成相关基因表达分析

1.3.1 引物设计及合成 根据SGAs合成通路，选取StHMG1，StSQS1，StCAS，StSSR2，StGAME4，StGAME8a，StSGT1，StSGT2，StSMT1和StCYP51G等结构基因，送上海生物工程公司合成。

1.3.2 总RNA的提取及cDNA的合成 采用TaKaRa提取试剂盒提取马铃薯资源1-76、6-36、5-36、6-1块茎和芽中的总RNA(图1)。

M. DL2000；1～4为马铃薯块茎(1-76、6-36、5-36、6-1)的RNA；5～8为马铃薯芽(1-76、6-36、5-36、6-1)的RNAM. DL2000; 1-4 is the RNA of potato tubers (1-76, 6-36, 5-36, 6-1);5-8 is the RNA of potato buds (1-76, 6-36, 5-36, 6-1)图1 马铃薯块茎、芽RNA电泳图Fig.1 RNA electrophoresis of potato tubers and buds

cDNA的合成参照5×Prime Script TMRT Master Mix(Perfect RealTime)(TaKaRa)说明书进行，整个过程在冰上。反应体系20 μL：5×Prime Script RT Master Mix(Perfect Real Time)4 μL，总 RNA体积等于1000除以RNA浓度，用RNase Free ddH2O补充至20 μL。反应条件：37 ℃ 15 min，85 ℃ 3 s，4 ℃无限循环。将得到的cDNA溶液稀释至200 ng/μL，-20 ℃保存备用。

1.3.3 qRT-PCR检测 以cDNA为模板，Actin为内参基因。反应体系20 μL：cDNA模板2 μL，引物-F(10 μmol/L)0.4 μL，引物-R(10 μmol/L)0.4 μL，TB Green premix Ex Taq II 10 μL，ddH2O 7.2 μL。Real Time PCR反应程序为：95 ℃ 30 s；95 ℃ 10 s，61 ℃ 32 s, 40个循环；95 ℃ 60 s，60 ℃ 60 s，55 ℃ 10 s。

2 结果与分析

2.1 4种马铃薯资源在不同储藏条件下的表型变化

对4种马铃薯资源分别进行地窖和光照储藏60 d(图2)后，地窖贮藏的马铃薯开始发芽，而光照下的马铃薯芽长至1.5 cm左右，皮色发绿。推测由于储藏温度对马铃薯的表型有一定影响。

a为地窖贮藏60 d，b为光照贮藏60 da is cellar storage for 60 days, b is light storage for 60 days图2 4种马铃薯资源储藏60 d后的变化Fig.2 Changes of four kinds of potato resources after storage for 60 days

2.2 糖苷生物碱含量分析

高效液相色谱—串联质谱法(HPLC-MS/MS)测定显示，马铃薯块茎中SGAs含量变化范围为0.034～3.360 mg/g，芽中SGAs含量变化范围为24.518～41.579 mg/g。2种紫皮马铃薯资源(1-76、6-36)块茎和芽中的SGAs含量变化无显著差异，2种白皮马铃薯资源(5-36、6-1)中SGAs含量在块茎中差异性显著，但在芽中差异不显著(表1)。因此，选用2种白皮马铃薯资源为试验材料进行相关基因表达性分析。

2.3 SGAs生物合成相关基因在马铃薯资源中的表达量分析

使用qRT-PCR方法检测了2种白皮马铃薯资源(5-36、6-1)SGAs合成途径中StHMG1，StSQS1，StCAS，StSSR2，StGAME4，StGAME8a，StSGT1，StSGT2，StSMT1和StCYP51G10个相关基因的相对表达量。块茎中，SGAs含量5-36显著高于6-1(表1)，StCAS，StSSR2，StGAME4，StSGT1，StSGT2和StSMT1这6个基因的表达量5-36显著高于6-1，其他基因在5-36中的表达量低于或接近6-1(图3-a)；芽中，SGAs含量5-36略高于6-1，表达量检测发现，除了StSMT1基因外，其他9个基因的表达量在5-36显著高于6-1(图3-b)。通过基因表达量结果发现，SGAs生物合成途径中部分基因(StCAS，StSSR2，StGAME4，StSGT1，StSGT2)的表达量与SGAs含量之间的关系密切。

表1 不同马铃薯资源块茎、芽中的SGAs含量

图3 SGAs生物合成相关基因在马铃薯资源(5-36、6-1)块茎(a)和芽(b)中的表达量变化Fig.3 Changes in expression of SGAs biosynthesis-related genes in potato resources (5-36, 6-1) tubers (a) and buds (b)

由表1可知，所有马铃薯芽中的SGAs含量显著高于块茎。在马铃薯资源5-36块茎和芽不同组织中，参与SGAs合成的相关基因表达量存在差异，其中StHMG1，StSSR2和StGAME8a基因的表达量在芽组织中高于块茎，其他基因的表达则相反或相近。然而在马铃薯资源6-1块茎和芽不同组织中，基因表达量分析结果发现，仅有StSSR2和StGAME8a基因的表达量在芽中显著高于块茎，其他基因在芽中的表达量低于块茎或二者相当(图4)。表明不同马铃薯资源在调控不同组织SGAs的合成途径中存在共同机制，但有细微差别。此外，参与SGAs合成的部分基因可能参与了其他生物合成过程。

图4 SGAs生物合成相关基因在5-36(a)和6-1(b)块茎和芽中的表达量变化Fig.4 Changes in expression of SGAs biosynthesis-related genes in 5-36(a) and 6-1(b) tubers and buds

3 讨 论

马铃薯中SGAs具有多种生物学功能，尤其马铃薯块茎中其含量过高将影响食用安全，因此SGAs合成调控机理一直以来是研究的热点。本试验中，不同马铃薯资源块茎和芽中的SGAs含量差异较大，这与前人研究结果相符[27-29]。测定的不同马铃薯资源块茎中α-茄碱含量为0.016～1.593 mg/g，α-卡茄碱含量为0.018～1.766 mg/g，马铃薯资源芽中α-茄碱含量为10.812～19.047 mg/g，α-卡茄碱含量为13.706～22.533 mg/g，α-卡茄碱含量比α-茄碱含量高，符合前人研究结果[30-31]。4个马铃薯资源块茎中SGAs含量为0.034～3.360 mg/g，芽中SGAs含量为24.510～41.579 mg/g，在储藏60 d后有2个马铃薯资源1-76(0.123 mg/g)和6-1(0.034 mg/g)块茎中的SGAs含量未超出安全食用范围(1 mg/g)(干质量)，其余马铃薯资源块茎和芽中的SGAs含量均已超出安全食用标准。

SGAs的合成是通过甲羟戊酸途径实现的，其中羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶(HMG1)基因是SGAs甲羟戊酸合成途径中的第一步催化酶，马铃薯块茎中SGAs含量与HMGR和鲨烯合成酶(PSS1/SQS)基因的表达量呈正相关[32]，但本试验结果中StHMG1基因的表达量与SGAs含量变化规律不一致，实验材料的不同是造成与前人研究存在差异的原因之一，StHMG1基因在马铃薯中以基因家族的形式存在，但是该家族中不同基因的功能存在差异。环阿屯醇合成酶(CAS1)位于2,3-环氧化鲨烯合成环阿屯醇的分支点，StCAS基因表达量在不同资源中与SGAs含量变化规律一致，但是StCAS基因表达量在同一资源不同组织中与SGAs变化规律相反，SGAs含量低的块茎中，该基因的表达量高，推测其不仅参与SGAs的生物合成过程，还参与了其他生物合成过程。马铃薯甾醇侧链还原酶2(StSSR2)是以环丙烯醇为原料合成SGAs的前体胆固醇的关键酶，位于茄碱和油菜素内酯合成的分支点，其不仅催化甾醇类物质合成，而且同家族的StDWF1基因催化油菜素内酯合成[33-34]。本试验中，StSSR2基因主要在马铃薯芽中表达，块茎中几乎不表达，并且，在SGAs含量高的马铃薯资源(5-36)不同组织中，该基因的表达量均高于SGAs含量低的马铃薯资源(6-1)，表明该基因可能主要负责马铃薯SGAs的合成。此外，敲除或沉默StSSR2基因均可以降低马铃薯中SGAs含量[35-37]。

研究发现，马铃薯中StSSR2基因主要在块茎和茎中表达，叶片次之，根和匍匐茎中表达量最少[38]，但在芽中还未见报道，StSSR2基因的功能有待进一步深入研究。细胞色素P450单加氧酶基因(Glycoalkaloid Metabolism 4，GAME4)催化SGAs生物合成途径下游的生化反应，沉默该基因使马铃薯块茎中SGAs含量显著降低[39-40]。本研究中，StGAME4基因的表达模式与StCAS基因一致，同一资源不同组织中该基因的表达量与SGAs含量变化规律相反。SGAs生物合成过程中的糖基化过程由半乳糖基转移酶(SGT1)和葡糖基转移酶(SGT2)催化合成。安然等[41]研究发现SGT1、SGT2和SGT3基因被敲除后，马铃薯块茎中SGAs含量降低。McCue等[42]抑制StSGT1基因的表达，结果发现块茎中的α-茄碱几乎被完全抑制，但α-卡茄碱的积累水平却提高了，导致总体SGAs的含量没有太大改变。本试验结果表明，StSGT1，StSGT2基因表达模式与StCAS基因一致，推测这2个基因负责不同马铃薯资源中SGAs含量，而对同一资源不同组织中SGAs含量贡献较小。甾醇C-24-甲基转移酶1(SMT1)作为植物甾醇类生物合成分支的关键酶，将环丙烯醇转化为24-亚甲基环丙烯醇，前人研究发现在马铃薯中过表达大豆中GmSMT1基因，叶片和块茎中总SGAs及游离胆固醇含量显著下降，与SGAs含量改变一致[43]。然而，本实验中StSMT1基因的表达量与SGAs含量变化规律存在差异。钝叶醇14-α-去甲基化酶(StCYP51G)主要参与马铃薯中植物甾醇(菜油甾醇和谷甾醇)的生物合成，StCYP51G基因在不同马铃薯资源块茎和芽中的表达量与SGAs含量变化规律相关性不高。

4 结 论

4种马铃薯芽中的SGAs含量显著高于块茎，块茎中SGAs含量变化为0.034～3.360 mg/g，芽中SGAs含量变化为24.510～41.579 mg/g，4种马铃薯芽及马铃薯6-36(0.272 mg/g)和5-36(3.360 mg/g)块茎中的SGAs含量均已超出安全食用值(1 mg/g，干质量)，对人类安全食用存在风险。不同马铃薯资源中，SGAs的调控机制与不同组织中SGAs合成机制可能存在差异，为深入解析不同马铃薯资源中SGAs的合成机理以及马铃薯的综合开发利用提供一定的理论依据。