基于GC-MS的不同产地铁皮石斛代谢物差异分析

李紫曦，牟美睿，杨仁杰，刘海学

(1. 天津农学院园林园艺学院，天津 300384；2. 农业农村部环境保护科研监测所，天津 300191；3. 天津农学院工程技术学院，天津 300384；4. 天津农学院农学与资源环境学院，天津 300384)

【研究意义】石斛的来源和品种确定是用药过程中的重要环节，明确铁皮石斛来源对保证铁皮石斛用药准确性具有重要意义。【前人研究进展】铁皮石斛(DendrobiumofficinaleKimuraet Migo)属兰科多年生草本植物，因其含有多种生物碱、多糖、酮类等成分[1]具有控制糖尿病和抗肿瘤等功效，是一种药用价值极高的传统中药材。铁皮石斛繁殖能力较低，在自然条件下发芽率不足5%，野生资源较少，因而市售大部分为栽培品[2]，但药用功效及质量高低不一，《中国药典》2015版[3]明确指出，不同来源的铁皮石斛性质及药效具有较大差异，同时生长环境可以显著改变铁皮石斛体内的代谢成分[4]，有研究表明不同的生长环境对铁皮石斛的有效成分会产生影响，而野外环境则更利于积累有效性较高的次生代谢物[5-6]。【本研究切入点】本文基于气相色谱质谱联用仪技术(GC-MS)对6份来自不同产地铁皮石斛样品进行代谢组学分析，同时结合主成分分析、偏最小二乘判别分析、聚类分析等多元统计分析方法查找标志性差异代谢物，构建石斛代谢组学的产地鉴定方法。【拟解决的关键问题】为确定铁皮石斛植源性鉴定的考量指标提供参考，同时为铁皮石斛质量控制提供理论向导和技术支持[7]。

1 材料与方法

1.1 试验材料

供试材料为天津农学院农业分析测试中心保存的铁皮石斛样品，分别为来自贵州铜仁市沿河县(11号)、广东韶关仁化县(21号)、浙江温州雁荡山镇(31号)、云南普洱思茅镇(41号)、湖南郴州资兴市(51号)的野生石斛品种和来自湖南的室内栽培石斛品种(61号)。

1.2 仪器与试剂

1.2.1 仪器 METTLER TOLEDO AL204电子天平；新芝SB-5200DTDN超声波清洗机；Eppendorf Centrifuge 5920R冷冻离心机；凯航HH-2恒温水浴锅；睿科Reeko-Auto EVA全自动氮吹浓缩仪；Aglient 7890A-5975C型气相色谱质谱联用仪；Aglient HP-5MS毛细管气相色谱柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm)。

1.2.2 药品与试剂 乙腈、异丙醇、吡啶、正庚烷，纯度均为色谱纯；盐酸甲氧胺、N-甲基N-三甲基硅烷三氟乙酰胺(MSTFA)、三甲基氯硅烷(TMCS)，质量分数均为99.9%；超纯水。

1.3 试验方法

1.3.1 样品制 参考张丽增等[8]方法，分别取6份试验材料长势相同的铁皮石斛成苗功能叶，液氮研磨至粉末，称取150 mg加入体积比为1∶1∶1的乙腈—异丙醇—水混合溶液，超声提取35 min(40 KHZ，4 ℃)后10 000 r/min离心1 min，取上清液100 μL氮气吹干。

1.3.2 GC-MS分析条件 色谱条件：升温程序为常温升至 100 ℃，色在 100 ℃下保持1 min，然后以10 ℃/min的速度升至280 ℃，保持 8 min，载气为纯度 99.999%的氦气，流量为 1.0 mL/min进样模式不分流，进样量1 μL。离子源和进样口温度分别保持在230和250 ℃，四级杆温度150 ℃，溶剂延迟4.5 min；质谱条件：EI能量-70 eV；离子源温度230 ℃；四级杆温度-150 ℃；溶剂延迟4.5 min；扫描范围-50～500 m/z；扫描速度2 scan/s。

1.3.3 衍生化处理 待有机试剂挥发尽后，进行衍生化处理，取10 μL盐酸甲氧胺吡啶溶液(40 mg/mL)加入样品中置于30 ℃恒温90 min后，向样品中加入30 μL衍生剂(MSTFA+1%TMCS)置于37 ℃恒温30 min，最后加入1 mL溶剂正庚烷(含20 μg/mL内标物十一烷)过0.22 μm微膜，转入GC进样瓶待上机。

1.4 数据处理

通过GC-MS光谱全波段扫描石斛叶片代谢物质，Agilent-MassHunter工作站对原始数据进行特征提取，最后得到保留时间(rt)及峰面积(intensity)，利用Origin 7.5绘制总离子流图；导出数据至Microsoft Excel 2016整理，并利用Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG)进行定性定量分析，通过SIMCA-P 13.0进行主成分分析(PCA)及偏最小二乘法—判别分析(PLS-DA)，使用 SPSS 23.0进行t检验(Student’st-test)，利用Omicshare平台进行聚类热图分析(HCA)。

2 结果与分析

2.1 代谢物GC-MS分析

对不同产地铁皮石斛进行GC-MS分析，通过总离子流图(图1)可以看出，6份石斛材料中共扫描出116个峰，出峰时间集中于12～20 min，但峰高及出峰时间存在品种间差异，经代谢组学数据库进行注释后，6份石斛材料中共得到71个代谢物，如表1所示，包括20种有机酸、11种氨基酸、20种糖及衍生物和20种化合物。其中由于铁皮石斛均属兰科植物，存在共有代谢物10种，如苹果酸、天冬氨酸、半乳糖等。除此之外，不同产地的石斛代谢物之间存在明显差异，其不同主要表现在糖类与有机酸上。糖类作为植物光合作用产生的单糖经特定酶催化后形成的化合物[9]，可以看出由于环境的不同会造成石斛体内代谢物的差异，因此可根据代谢物差异对石斛产地进行区分。

图1 不同产地铁皮石斛GC-MS分析总离子流Fig.1 GC-MS analysis of total ion chromatogram of Dendrobium nobile from different productions

表1 不同产地铁皮石斛GC-MS鉴定结果

续表1 Continued table 1

2.2 不同产地铁皮石斛差异代谢物鉴定

2.2.1 PCA分析 为清晰得出不同产地铁皮石斛之间的代谢物差异，首先利用主成分分析(PCA)的方法对不同产地石斛代谢物进行降维分析，得到二维与三维得分图(图2 a～b)进而判别栽培品种铁皮石斛与野生品种铁皮石斛之间的差异。通过PCA分析可以得知，不同产地铁皮石斛代谢物间存在显著差异，第1主成分(t1)可以将栽培品种与贵州、广东野生品种区分开，第2主成分(t2)可以将栽培品种与浙江、温州野生品种区分开，但不能将湖南品种与栽培品种区分开，由于主成分分析仅能较好的反映原始数据，无法忽略组间差异，因此后续将采用有监督的分析方法对湖南品种与栽培品种进行区分。

图2 不同产地铁皮石斛PCA二维(a)和三维得分图(b)Fig.2 Two-dimensional (a) and three-dimensional scores (b) of PCA of Dendrobium from different products

2.2.2 PLS-DA分析 为进一步鉴别野生石斛与栽培石斛之间的差异代谢物，对代谢物含量归一化处理后进行偏最小二乘判别分析(PLS-DA)得到PLS-DA得分图(图3-a)，R2=0.984，Q2=0.997，同时为防止模型过拟合进行交叉验证后所有点均小于原始R2，说明模型拟合较好且具有可行性。通过得分图我们可以看出，有监督的分析方法能较好的将湖南野生石斛品种与栽培品种区分开，进而得出投影变量权重值(VIP)，图中柱子高度与对模型贡献值越高(图3-b)，差异越显著[10]。

图3 不同产地铁皮石斛PLS-DA得分图(a)和VIP图(b)Fig.3 PLS-DA score map of Dendrobium of different production lines (a) and VIP map (b)

2.2.3 差异代谢物鉴定 结合PLS-DA分析得出的VIP图，再利用SPSS对筛选出的差异代谢物进行t检验，结合2种方法(VIP>1，P<0.05)筛选出两地石斛的差异代谢物20种，分别为6种有机酸、6种糖类、3种氨基酸及5种化合物(图4-a)，其中9种代谢物为湖南野生品种特有，包括3种有机酸(丁酸、丁烯酸、乙酰乙酸)、3种氨基酸(丝氨酸、甘氨酸、天冬酰胺)、2种糖及衍生物(葡糖醛糖、木糖)和1种化合物(苄醇)，而11种代谢物为室内盆栽品种特有，包括3种有机酸(丙酸、十六烷酸、丁二酸)、4种糖及衍生物(阿拉伯糖、核糖、果糖、塔洛糖)、1种氨基酸(苏氨酸)及3种化合物(二醇、抗坏血酸、苯丙醇胺)，对差异代谢物以差异倍数绘制火山图(图4-b)，20种差异代谢物分散在左右两侧，差异显著。

图4 湖南野生与室内栽培铁皮石斛差异代谢物(a)与差异代谢物火山图(b)Fig.4 Different metabolites (a) and differential metabolites of Hunan wild and indoor cultivated Dendrobium candidum (b)

图5 差异代谢物聚类分析热图Fig.5 Cluster analysis heatmap of differential metabolites

2.3 差异代谢物聚类热图分析

利用Omicshare 平台根据差异代谢物鉴定筛选出的差异代谢物对不同产地铁皮石斛进行代谢物和品种两个维度的聚类热图分析(HCA)，如图5所示，树形热图中横坐标代表不同产地铁皮石斛品种，纵坐标代表差异代谢物，其中红色表达代谢物显著上调，响应蓝色代表显著下调，通过图中我们可以看出，6号室内栽培品种中苏氨酸显著上调，区别与其他品种，而丙酸显著下调区别于其他品种，同时根据聚类热图分析可以看出，20种差异代谢物可以很好的将野生石斛品种与室内栽培品种区分开。

3 讨 论

铁皮石斛含有多种化学成分，主要包括多糖、黄酮、生物碱、氨基酸等，也是铁皮石斛发挥药理活性的物基础[11]。本试验基于气质联用气相色谱质谱联用技术，对6份不同产地的铁皮石斛成苗代谢物进行野生种于栽培种的差异分析，找到包括丙酸、苏氨酸等在内的20种显著差异代谢物，大多为糖类(葡糖醛糖、木糖、阿拉伯糖、核糖、果糖、塔洛糖)、酸类(丁酸、丁烯酸、乙酰乙酸、丙酸、十六烷酸、丁二酸)，其次为氨基酸类(苏氨酸、甘氨酸、丝氨酸)和化合物类(苄醇、天冬酰胺、二醇、抗坏血酸、苯丙醇胺)。有研究表明，糖类、氨基酸和有机酸含量的增加能提高植物的抗逆性[12-13]。刘建兵[14]在研究中发现，马尾松苗木在干旱胁迫下，体内脯氨酸及游离氨基酸含量显著增加，同时高荣嵘等[15]在研究花生幼苗受到盐胁迫后发现，游离氨基酸的含量也表现出显著上升，包雨卓[16]在分析冬小麦在低温胁迫下的代谢物质变化时发现大部分糖类、氨基酸和有机酸显著增加，说明了冬小麦通过大部分糖类、氨基酸和有机酸的增加来抵御低温的胁迫。多种植物在对生长环境适应的过程中都表现出糖类、有机酸等物质显著增加的现象，而多糖也是铁皮石斛花中的主要活性组分[17]，在本研究中通过对比野生石斛与室内栽培石斛品种差异代谢物的种类与含量，反映野生种与栽培种石斛差异代谢物也主要体现在糖类、氨基酸及有机酸类，这可能是由于栽培品种石斛为了适应生长环境从而使体内代谢水平发生变化。

本研究以不同产地铁皮石斛为材料进行差异代谢物分析得出，野生品种石斛与栽培品种石斛在代谢物种类及含量水平上存在显著差异，通过分析比较不同产地间铁皮石斛小分子代谢物从而得出20种主要差异代谢物，从而达到鉴定不同产地铁皮石斛的目的，为铁皮石斛种质鉴定研究提供科学依据。

4 结 论

(1)经GC-MS分析后，6份石斛材料中共得到71个代谢物，包括20种有机酸、11种氨基酸、20种糖及衍生物和20种化合物。其中存在共有代谢物10种，如苹果酸、天冬氨酸、半乳糖等。

(2)经PLS-DA分析后得出，主要差异代谢物分别为6种有机酸、6种糖类、3种氨基酸及5种化合物，其中9种代谢物为湖南野生品种特有，11种代谢物为室内盆栽品种特有。

(3)对差异代谢物利用聚类分析，根据聚类热图分析可以看出，20种差异代谢物可以很好的将野生石斛品种与室内栽培品种区分开，此方法具有可行性。