鲀毒鱼毒素检测及物种鉴定技术研究进展

谢瑞彬，李 会，张 娟，于文杰，王 楠，高 洁，柳淑芳，陈爱亮,*

（1.中国农业科学院农业质量标准与检测技术研究所，北京 100081；2.中国水产科学研究院黄海水产研究所，山东 青岛 266071）

河鲀，俗称河豚鱼，泛指硬骨鱼纲（Osteichthyes）鲀形目（Tetraodontiformes）鲀科（Tetraodontidae）的鱼类。鲀科鱼类在世界各地广泛分布且种类众多，包括29 个属200 个种，其中我国的记录种有54 种，主要分布于四大海区及近海江河，是我国重要的鱼类资源。经济价值较高的种类多为东方鲀属（Takifugu），如红鳍东方鲀（T. rubripes）、假晴东方鲀（T. pseudommus）、暗纹东方鲀（T. obscurus）、菊黄东方鲀（T. flavidus）、黄鳍东方鲀（T. xanthopterus）、虫纹东方鲀（T. vermicularis）等。我国河鲀鱼类年产量3×104～4×104t，约占世界河鲀总产量的70%[1]。

河鲀毒素（tetrodotoxin，TTX）系天然生物碱类神经毒素，因最早从河鲀中分离而得名，是已知毒性最强的非蛋白类生物毒素之一，毒性为氰化钠的1 250 倍，麻醉作用为可卡因的16万 倍，毒性作用快，且尚无特效解毒剂，中毒者死亡率极高。部分河鲀体内含有剧毒的TTX，最少仅需2 mg即可致死一位50 kg的成年人，因此其又被称作鲀毒鱼。

导致TTX中毒原因主要包括：部分消费者抱有侥幸心理，盲目尝鲜引发中毒；含TTX的水产品同其他水产品混在一起被捕捞或捡拾，误食导致中毒；个别生产经营者未对食品原料进行严格筛选，导致含TTX的食品混入[2]。鲀毒鱼中毒事件在全球均有发生，表1例举了近20 年中国、日本、孟加拉国和泰国等国家及地区因误食河鲀致死的案例。

表1 全球河鲀中毒事件举例Table 1 Global cases of puffer fish poisoning

由于TTX致死率高、潜伏期短，且没有解毒剂或特效药[10]，目前只能通过洗胃、供氧等辅助手段救治中毒患者，因此，TTX的检测、鲀毒鱼的鉴定对于预防鲀毒鱼中毒和及时救治十分重要。本文在梳理TTX性状及中毒机理的基础上，对关于鲀毒鱼的检测技术从两部分进行综述：一是针对鲀毒鱼体内TTX的检测；二是针对鲀毒鱼物种的鉴定，同时简述了鲀毒鱼检测目前存在的问题，提出了未来鲀毒鱼检测技术的发展方向，以期能减少鲀毒鱼引起的食物中毒事件。

1 河鲀毒素性质及中毒机理

1.1 河鲀毒素的化学性质与结构特征

TTX最早于1909年由日本科学家Yoshizumi Tahara在河鲀体内发现，并因此得名[11]。1950年Hirata Yoshimasa开发出纯晶体毒素制备方法[11]。1964年Woodward发现TTX的化学结构为C11H17O8N3（分子质量为319 Da），为笼状极性分子[12]。TTX是一种剧毒的非蛋白神经毒素，经腹腔注射对小鼠的半数致死量为80 μg/kg[13]。

TTX纯品为无臭无色的针状晶体，易潮解，微溶于水，不溶于有机溶剂；对酸作用稳定，在碱性溶液中易分解。TTX化学性质非常稳定，一般食物制备过程（如高温烹饪、冷冻保藏、腌制或曝晒）均不能将其分解或破坏，即使唾液淀粉酶、胰蛋白酶、乳化酶和糖转化酶等酶类也难以将其分解，只有在高温加热30 min以上或在碱性条件下其才能被分解。其衍生物为白色无定形酸性物质，迄今已报道了40多个TTX的结构类似物[14]，这些类似物因缺乏商品标准物质使其研究受到严重限制。

关于河鲀体内毒素的起源众说纷纭，目前最被接受的说法是河鲀自身分泌少量TTX，大量TTX则是通过海洋食物链进行生物积累的[15-18]。因此，不同个体、不同地区、不同季节河鲀体内的毒素水平均有所差异，甚至同一个体、不同年龄的毒素含量也有所不同[19-21]，如在产卵季节，河豚肝脏中积累的毒素会转移到卵巢中，使卵巢毒性增强[22]。

1.2 河鲀毒素的作用机理及中毒表现

TTX通过与钠离子通道受体结合，阻断具有电压依赖性的钠离子通道，从而阻滞动作电位，导致相关的生理活动受阻碍[23]。而TTX衍生物的毒性程度随结构改变而变化，主要是每个类似物对钠离子通道的亲和力不同，受其结构中羟基数量和位置影响[24]，如11-酮化TTX的毒性比TTX高4～5 倍，而5-脱氧TTX、3-脱氧TTX、4-半胱氨酸TTX和脱水TTX的毒性很弱，可忽略不计，张晓春等[25]描述了4 种TTX中毒级别的症状（表2）。TTX中毒的程度取决于所摄入TTX的剂量、摄入TTX后的时间、体内的水合状态以及中毒前受害者的总体健康状况。

2 河鲀毒素常用检测方法

2.1 生物检测技术

2.1.1 小鼠生物测定法

小鼠生物测定法是最早使用的、全世界公认的检测食品中TTX毒性的标准方法[26]。该方法使用体质量为20～22 g的健康雄性小鼠，腹腔注射不同浓度的TTX，记录小鼠的死亡时间，死亡时间的倒数与TTX的剂量存在线性关系，从而实现定量。TTX的致死效率以“鼠单位”（mouse unit，MU）表示，1 MU指小鼠腹腔注射含TTX的提取剂后30 min内杀死小鼠需要的最少毒素剂量[27-28]。

该方法操作简单，不需要昂贵的仪器设备，但小鼠的死亡时间受饲养条件、小鼠的健康程度、TTX的溶剂等多种因素影响，因此重复性差、目标性差、灵敏度低，且不能对毒素进行准确定量，不适用于临床上的尿液、血液样本检测；此外，该方法使用动物，在伦理上存在争议。

2.1.2 免疫分析法

免疫分析是利用抗原抗体特异性结合原理来对靶标物质进行快速检测的一种分析方法。其中，最常见的是酶联免疫吸附测定（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）。1992年，Raybould等[29]在小鼠体内诱导产生抗TTX的单克隆抗体，并使用碱性磷酸酶进行标记，通过酶标仪进行定量检测。Gong Huizhi等[30]利用TTX单克隆抗体开发了一种间接免疫竞争模式的ELISA试剂盒，该方法检出限可达40 μg/kg。除了ELISA，近年来发展的胶体金免疫层析技术集成了免疫分析的特异性、层析技术的简便性以及纳米金颜色变化等优点，还具有简单、方便、快捷以及便于现场应用等优点，在医疗诊断、食品安全等领域受到广泛应用。基于此技术， Li Yue等[31]开发了TTX胶体金免疫层析试纸条，实现了TTX可视化检测，灵敏度达到10 μg/kg。

TTX抗体对TTX具有非常高的特异性，对其衍生物或其他毒素没有交叉反应，从而使免疫分析具有很好的特异性[32]。除此之外，免疫分析还具有快速灵敏等优点，可在2 h内实现TTX的准确定量分析[33]。同时免疫分析样品用量少，方便现场测定，目前已经研发出了商品化的TTX ELISA试剂盒[34]。研究还发现，单克隆抗体与TTX结合还能中和其毒性，减少中毒危害[35]。

2.1.3 表面等离子共振生物传感器

表面等离子共振（surface plasmon resonance，SPR）生物传感器是基于芯片表面抗体识别TTX形成复合物过程中引起的界面折射率与一定波长的入射光在界面上形成的反射光衰减程度存在相关性，从而实现检测的一种光学检测仪器。由于TTX分子较小，在界面上发生的折射率变化较小，因此，SPR生物传感器对TTX的分析通常需要采用相互抑制或竞争等形式来增加信号强度，如组装抗TTX的SPR生物芯片[36]、纳米颗粒标记[37-38]等。Yakes等[39]首次使用SPR生物传感器直接检测TTX，这种直接测定法能够在3 min内检测到待检样品溶液中的TTX，检出限约2 ng/mL。

基于抗体的SPR生物传感器方法分析速度快、对毒素检测的准确度较高，具有高灵敏度和特异性。生物试剂的使用少，无需放射性标记或实验动物，可进行实时和无标记分析，已显示出广阔的应用潜力。将SPR生物传感器结合最新的低噪声检测系统[39]，能够降低系统中噪声的同时，提高检测的可重复性，使得直接检测成为可能，但SPR生物传感器需要的仪器成本较高，限制了其在现场检测中的应用。

2.1.4 适配体检测技术

核酸适配体是一种新型生物识别分子，通过指数富集的配体系统进化技术（systematic evolution of ligands by exponential enrichment，SELEX）从单链寡核苷酸文库中筛选出能够和靶标分子特异性结合的单链DNA或RNA分子[40]。适配体又称化学抗体，其亲和力及特异性与抗体相似，但与抗体相比，具有稳定性好、检测方式多样等优点，近年来在医疗诊断、食品安全检测中受到广泛关注。

邵碧英等[41]采用SELEX与聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）技术制备了78 bp的单链DNA适配体，该适配体可与TTX特异性结合，用荧光染料法进行检测，TTX的检出限为10－6mol/L，检测时间只需要10 min。Zhang Man等[42]在传统方法的基础上进行改进，将特异性结合TTX的适配体序列与磁珠结合，并使用能与适配体互补的DNA序列与TTX竞争结合位点，然后对游离的DNA片段进行扩增放大检测信号，实现对TTX定量，检测灵敏度高达0.05 ng/mL，检测限低至0.265 pg/mL，回收率为99.67%～116.67%。

TTX适配体检测技术不需要昂贵的设备和复杂的操作，成本低、速度快、灵敏度高、定量便捷，可用于血清样品中TTX的检测[43]，显示出良好的应用前景。

2.2 理化分析技术

2.2.1 荧光分光光度法

荧光分光光度法是TTX的早期化学检测方法，在TTX样品中加入一定量的NaOH后，在较高温度下（80～120 ℃）加热，TTX及其类似物经化学转化为能发出荧光的2-氨基-6-羟甲基-8-羟基-喹唑啉（俗称C9碱），然后测定其荧光强度[44]。

沈晓书等[45]在荧光分光光度法基础上进行了改进，用水和异丙醇混合成的碱性溶液对TTX进行碱解，并在碱解过程中使用微波辅助，结果发现，此方法大大增强了荧光强度，使检测限降低至0.05 μmol/L。

荧光分光光度法检测TTX操作简便、检测时间短、灵敏度高，但由于毒性较小的TTX类似物也可转化为C9碱，会导致假阳性，加大了检测结果的不确定性。

2.2.2 色谱检测法

近年来，为了精确定量TTX，色谱常被作为首选方法[3]。色谱法又称色层法或层析法，其原理是利用TTX与其他组分同固定相和流动相之间作用力（分配系数、吸附能力、离子交换作用等）的差别，当固定相和流动相作相对移动时，各组分在两相间进行多次平衡，最终实现相互分离。色谱法有多种，包括高效液相色谱法（highperformance liquid chromatography，HPLC）、气相色谱法（gas chromatography，GC）、薄层色谱法（thin-layer chromatography，TLC）。色谱法通常与其他分析方法联用，从而实现对TTX及其类似物的定性及定量。

崔建洲等[46]将HPLC与紫外检测器结合对河豚毒素进行检测，其将河鲀鱼肝脏用醋酸进行粗提取，然后经过C18固相萃取柱，用乙醇-醋酸-水洗脱，使用紫外检测器进行检测。该方法的检出限为20 μg/kg，回收率为87.7%～101.7%。

由于TTX自身不会发出荧光，因此，需要进行前处理才能利用荧光检测器检测。Dell’Aversano等[47]开发出一种由HPLC通过柱前氧化和荧光检测确定TTX的方法。样品在进柱前利用过氧化物进行氧化，接着以醋酸为流动相，C18反向柱为固定相进行梯度洗脱，最后根据保留时间、峰面积对样品进行定性及定量。O’Leary等[48]则通过HPLC柱后衍生和荧光检测进行分析，柱后衍生后使用热浓缩的NaOH溶液将TTX转换成C9碱来产生荧光信号强度，TTX最低检出限为5 ng/mL。

色谱法是一种很好的分离手段，其定量能力强，但定性以及结构分析能力较弱，需要与其他检测器结合使用。由于TTX不具有挥发性，采用GC检测需将TTX转化为易挥发的C9碱衍生物，延长了检测时间。HPLC-紫外检测灵敏度有限，与之相比，HPLC-荧光检测对于TTX的检测应用相对广泛，但是TTX种类繁多，对荧光的响应强度相差较大，这在一定程度上限制了该方法的应用。

2.2.3 质谱检测法

质谱法是通过将TTX及其类似物转化为运动的气态离子并按质荷比（m/z）进行分离并记录其信息的分析方法。根据质谱图提供的信息可以进行定性和定量分析以及TTX衍生物的结构分析等。

质谱检测将TTX或其类似物打碎成分子质量不同的片段，其官能团及结合键的片段化模式已被广泛研究，TTX的特征片段有m/z302（失去1 个水分子）、284（失去3 个水分子），并且在m/z256、178和162处产生特征片段。6-表TTX在m/z302、284、256、178和162处产生特征片段。4-表TTX、11-去甲基TTX-6-(S)-醇、4,9-脱水TTX、5-脱氧TTX和5,6,11-三羟基TTX具有共同的m/z162片段。11-去甲基TTX-6-(S)-醇和11-去甲基TTX-6,6-醇都具有m/z178的片段。5-脱氧TTX和11-脱氧TTX在m/z176处产生一个特征片段。5-脱氧TTX和5,6,11-三羟基TTX在m/z146处产生特征性片段。11-酮化TTX在m/z336、318（失去1 个水分子）、300（失去2 个水分子）、282（失去3 个水分子）以及m/z178和m/z162处产生特征片段。

质谱法可以有效地定性分析化合物，但是对于混合物的分析却无能为力，因此，常与具有分离作用的色谱分析法联用。Bane等[49]使用LC-MS技术成功对TTX进行定量。样品组织用醋酸提取TTX，然后注入C18柱，使用醋酸-甲醇溶液进行洗脱，洗脱液注入质谱仪中电离成碎片离子，通过分析特征性碎片离子实现对TTX、11-去甲基TTX-6(S)-醇、11-脱氧TTX的分别定量。该方法的定量限为0.136 μg/g，检出限为0.041 μg/g。

TTX也可以通过GC-MS进行分析，但由于TTX是强极性物质，不能直接进行测定，需要额外的衍生化处理才能适用于GC。柳洁等[50]采用体积分数3%乙酸-甲醇溶液从样品中提取TTX，使用Oasis MCX固相柱净化，样品液中加入3 mol/L KOH溶液和甲醇，二甲基甲酰胺将TTX转化成C9碱，经Oasis亲水亲脂平衡固相萃取柱净化，再用硅烷化衍生剂衍生，质谱检测器进行定性、定量分析，定量限为5.0 ng/mL，检出限为1.0 ng/mL。

质谱法检出限低、灵敏度高，能够提供丰富的结构信息，解决了TTX及其衍生物的结构分析难题，定性分析结果可靠、用样量少、分析范围广，几乎可以检测TTX所有的衍生物。LC-MS只需要简单的样品制备，并且与HPLC-荧光检测和HPLC-紫外检测相比，可提供更低的检测限，是目前TTX分析的主流方法。当然质谱法分析需要昂贵的大型仪器，其成本高、操作复杂，且需要专业人员操作。

2.2.4 核磁共振检测法

核磁共振（nuclear magnetic resonance，NMR）对TTX的检测是通过强磁场对TTX进行辐射，TTX中的原子核自旋对射频辐射进行吸收，发生核能级的跃迁，从而实现对TTX及其类似物成分、结构进行定性及定量分析。

Yotsu-Yamashita等[51]将色谱分离纯化后的11-酮化TTX粉末用CD3COOD-D2O复溶，利用NMR仪对其进行分析，以600 MHz的频率记录1H NMR谱。根据频率谱图与11-酮化TTX标准品信号强度比较，将半纯化的11-酮化TTX定量为约20 μg/g。1962年，定量NMR问世并应用于化合物的纯度测定[52]，实现了不需要标准品即可定量的检测。Watanabe等[53]经过亲水作用色谱柱分离后用二维NMR定量了半乳糖型TTX、内酯型TTX、表位型TTX和脱水型TTX混合物，结果与串联质谱结果相符，证明了定量NMR技术还可用于TTX标准品的制备。

核磁共振检测技术不会破坏TTX结构，能够精确分析TTX及其衍生物的精细结构，但其缺乏分离功能，难以分析多组分混合物，且该方法提供原子水平上的信息量，灵敏度相对较低，定量误差大，而且需要的样品量大。

2.2.5 红外光谱检测法

用红外光照射TTX时，TTX分子中的化学键或官能团可发生振动吸收，不同的化学键或官能团吸收频率不同，在红外光谱上处于不同位置，能够通过已获得的化学键或官能团信息对TTX进行定性或定量。

Hasan等[54]从河鲀肝脏中提取并纯化得到TTX，利用红外光照射，在3 405 cm－1（—OH特征峰）、1 623 cm－1（胍基特征峰）、1 559 cm－1（COO－特征峰）以及1 120 cm－1（C—O特征峰）处有吸收峰，在279 nm波长处也有TTX的特征峰。

红外光谱技术检测速度快、操作方便、重复性好、灵敏度高、试样用量少、仪器结构简单，能够提供许多关于官能团的信息，有助于定性分析，但是样品需要有足够的吸光强度，且分离效果较好才能实现定量，对前处理过程要求较严，主要用于对标准品的纯度分析。

2.2.6 TTX前处理技术

鱼肉中基质复杂、含有较多的干扰物质，因此TTX检测的效果往往和前处理有较大关系。目前，TTX检测技术日益成熟，检测耗费的时间越来越短，但前处理过程却仍需要较长时间，成为了缩短整体检测时间的“短板”[55]。目前，常用的TTX样品前处理方法有液相提取与固相萃取，并辅以超声波、加热等手段[56]，从而实现对TTX的提取、纯化和富集。以LC-MS联用技术测定TTX的前处理为例，一般需采用乙酸-甲酯作为提取剂，通过漩涡振荡、水浴使蛋白质变性，采用超声辅助提取TTX，重复两次后，冷冻浓缩并使用磷酸盐缓冲液稀释，最后，稀释液使用免疫亲和柱和0.22 μm滤膜进行净化[57]。液相色谱检测对样品纯度要求较高，前处理步骤较多，用时达2 h以上，且需要较多仪器设备与有机试剂。

近年来，随着样品制备技术迅速发展，固相微萃取（solid-phase microextraction，SPME）技术作为一种最重要的新兴技术得到了广泛的认可与应用[58]。SPME技术是Authur等[59]在1990年提出的，该方法采用二氧化硅材质的针状纤维作为提取装置，将固定相涂在表面，然后，提取装置暴露在样品中，通过涂层吸附目标物，最后将其置于检测器中，从而将样品的采集、提取、富集和进样集于一体。

SPME技术如今已广泛应用于多种领域研究的样品制备，如环境分析[60]、食品检测[61]、重金属检测[62]以及临床医药试验[63]，同时也逐渐被应用于TTX的检测中。Chen Le等[64]将活的暗纹东方鲀麻醉后，把纤维萃取头插入其背部肌肉维持45 min后，进行洗脱，即可完成TTX的采样，与LC-MS/MS技术联用，检出限为2.3 ng/g，且具有较好的重现性和准确性。Tang Yijia等[65]在纤维萃取头采样的基础上进行了改良，采用纳米级材料制备纤维萃取头，使用LC-MS/MS进行检测，将采样时间缩短到15 min，检出限降低至0.52 ng/g。

与传统液相萃取相比，SPME技术极大地简化了前处理步骤，缩短了样品处理时间，减少了化学试剂的使用，操作简单，有利于现场实地采样，且具有生物相容性，可实现活体采样，通过对探针涂层以及探针的制备材料的摸索，可以提高选择性与提取效率[66]。

TTX的各种检测方法均有利弊（表3）。免疫检测技术具有较高的灵敏度，被广泛应用于样本初筛，在TTX的快速检测领域具有较好的发展空间，但需要昂贵的单克隆抗体。与ELISA方法相比，色谱法的成本较低。LC-MS是定性和定量测定TTX简单、有效和灵敏的方法[14]，虽然LC-MS和GC-MS联用技术都对设备、人员要求较高且需要使用有机溶剂，但是在定量检测方面具有无法取代的地位，已经用作TTX监管监测工具十多年，是分析TTX及其衍生物的成熟工具，对于分析TTX及其类似物非常稳定[67]，是欧洲食品安全局建议的使用方法。

3 鲀毒鱼物种鉴定方法

根据伍汉霖等[78]调查，我国共有35 种河鲀含有不同水平的TTX。最常引起食物中毒的是东方鲀属（Takifugu）鱼类[79]，该属有26 个种，绝大多数东方鲀属的鱼肉中含有TTX，有的器官甚至含有剧毒剂量的毒素（表4）。在鲀毒鱼体内，肝脏组织全年都有毒[80]；而在河鲀产卵的季节（5—7月），雌性河鲀卵巢的毒性为全年最高[81]，这种差异被认为是雌性个体在繁殖季节时TTX向卵巢聚集以及卵巢也会排出毒素造成的，以保护机体及鱼卵免受捕食者的侵害。然而，这种不同物种、不同器官甚至不同季节的TTX含量变化，导致毒素检测技术受采样部位的影响较大，如墨绿东方鲀肌肉无毒，肝脏有毒，雄鱼的性腺无毒，但雌鱼的性腺有剧毒（http://museum.ioz.ac.cn）。目前除了暗纹东方鲀和红鳍东方鲀外，其他河鲀物种仍被禁止进入市场，若以TTX含量为判断标准，则易发生假阴性检测。发展鲀毒鱼物种鉴定技术，即可避免发生假阴性的问题，而且物种鉴定不受采样部位影响使是鱼鳍、鱼鳞，甚至是鱼骨等组织，只要DNA未被降解，即可进行鉴定。

表4 东方鲀属物种体内TTX分布情况Table 4 TTX distribution in Takifugu

DNA作为生命的遗传物质，具有物种特异性，而且生物体内各个组织、器官的DNA序列相同，不受取样部位的影响。同时DNA具有一定的热稳定性，即使在烹饪后，使用DNA扩增技术仍可进行物种鉴定。对携带TTX的鲀毒鱼类进行物种鉴定，既有利于市场监管，能够有效预防鲀毒鱼引起的食物中毒事件，也能在中毒事件发生后及时采取正确的急救措施。

3.1 核苷酸测序法

确定物种的大多数遗传方法都是基于利用保守引物通过PCR扩增线粒体DNA（mtDNA）或核DNA（nDNA）区域后，进行测序并与数据库（GenBank）进行BLAST比对，从而实现物种鉴定。Bartlett等[82]首次提出法医信息核苷酸测序技术，与BLAST分析相似，它涉及对扩增的DNA片段进行测序，利用系统发育分析对物种进行遗传鉴定。

目前，最常用于脊椎动物物种鉴定的分子标记是线粒体基因（16S核糖体RNA（16S rRNA）、细胞色素b（cytochrome，Cyt b）和细胞色素氧化酶亚基I（cytochrome c oxidase subunit，COI）[83]基因）。线粒体Cyt b基因位点已在不同脊椎动物中得到了很好地表征[84]。研究发现，Cyt b在河鲀物种之间具有高突变率，因此，也常被用作河鲀间的物种鉴定标记[85]。然而，16S rRNA的高保存度使其不能成为河鲀种间鉴定的合适标记基因，COI基因虽然具有低序列变异性，但是其种内变异少，种内保守性较好，因此，适用于鲀毒鱼的物种鉴定[86]，也是目前动物物种鉴定的DNA条形码序列。沈青等[87]使用河鲀鱼COI基因的通用引物对90 份样品进行PCR扩增，并将测序结果与基因库Blast比对，从而实现对鲀毒鱼鱼种的鉴定。

测序鉴定操作简单，只需要简单扩增即可进行测序，但是成本较高，需要复杂的设备，而且更耗时，难以实现高通量，对于掺杂多个物种的混合样品而言会导致扩增产物不纯，难以进行测序。

3.2 限制性片段长度多态性技术

限制性片段长度多态性（restriction fragment length polymorphism，RLFP）技术是利用限制性内切酶能识别DNA分子的特异序列，并在特定序列处切开DNA分子，产生限制性片段的特性进行鉴定。对于不同种类的鲀毒鱼而言，DNA序列存在至少一个或多酶切位点的差别，这样就导致了用限制性内切酶进行酶切时，产生不同长度、不同数量的限制性酶切片段。将这些片段通过电泳、转膜、变性等技术分离，与标记过的探针进行杂交，即可分析其多态性结果。

Hsieh等[88]用10 种限制性内切酶BsaJI、Hinf I、BsaI、SAPI、TaqI、EcoR V、SapI、EarI、StuI和BsrDI对16 种河鲀进行了分析，得到了不同的限制性内切酶图谱。通过限制性内切酶片段长度多态性和序列分析获得的多态性，准确鉴定出16 种河鲀的近缘物种。RFLP也可用于实际样品的检测，Hsieh等[89]利用RFLP分析从中国台湾不同市场收集的60 种商业化干鱼片制品，首先对鱼肉样品进行简单PCR扩增，然后使用5 种限制性内切酶BsaJ I、AciI、Hinf I、TaqI和SapI对PCR产物进行酶切，成功地在9 h内检测出60 种样品中可能含有的17 种河鲀鱼，并识别出兔头鲀属[90]。

RLFP操作简单且反应时间短，获得的多态性片段为准确识别河鲀物种提供了一套新的遗传标记[91]。

3.3 荧光定量PCR

荧光定量（quantitative PCR，qPCR）技术是指在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对模板DNA进行相对定量分析的方法。

Jones等[92]采用基于TaqMan探针的qPCR方法，针对鲀科16S rDNA中的一个区域设计特异性较好的引物与探针，经实验证明能成功从105 种鱼中鉴定出20 种河鲀鱼，检出限达1.75 pg。

qPCR具有较高的灵敏度与特异性，且操作简单、耗时短，无需进行凝胶电泳，可实现相对定量，检测范围较广，成为鱼类物种鉴定的目前主流技术。本文整理了目前针对鲀毒鱼开发的qPCR方法引物探针序列（表5）。

表5 鲀毒鱼引物探针序列Table 5 Sequences of primers and probes used for qPCR for species identification of puffer fish

DNA条形码技术、限制性内切酶分析和qPCR都是鉴定物种的良好策略[96]。相较而言，测序方法昂贵且费时，还需要复杂的设备和操作；RFLP和qPCR方法具有快速、灵敏等优点。qPCR方法操作尤为简便，结合当前快速核酸提取方法以及高通量自动化提取检测设备，已经成为目前医疗诊断、食品安全检测领域核酸检测的主流方法[97]。当然，除了qPCR，还有更多的核酸检测方法如环介导等温扩增技术[98]、重组酶聚合酶扩增技术等已被用来进行鱼类物种的鉴别。

4 结 语

鲀毒鱼引起的中毒事件时有发生，对TTX进行精准检测或鲀毒鱼物种准确鉴定都是预防TTX中毒的重要措施。目前，比较常见的是河鲀毒素的检测，在各类TTX检测方法中，免疫层析技术更适用于TTX的快速半定量检测，LC-MS法适用于TTX及其多种衍生物的同步定量检测[99]。TTX的检测能有效预防中毒事件的发生，而且可以在中毒事件发生后迅速判断病因并及时采取有效的急救措施。但是由于河鲀体内毒素含量不一致，采样部位不同会影响检测结果。此外，对于监管部门来说，要禁止野生河豚在市场上流通，TTX检测无法完全满足需求，尤其是对于烤鱼片、鱼干等加工食品，鱼体不完整，难以根据形态外观识别出是否为鲀毒鱼。因此，使用各个部位具有一致性的DNA作为检测对象，对鱼类产品进行物种鉴定，可以获得更为准确可靠的判断结果。目前已经利用分子标记建立了各种序列分析的方法，能快速准确地实现物种鉴定。鲀毒鱼物种鉴定的发展有利于鲀毒鱼市场流通的监管、简化河鲀鱼物种证书的鉴定手续、促进河鲀鱼交易。

然而，目前对于鲀毒鱼检测方法的准确性、灵敏性、时效性等仍然存在诸多问题亟需解决：1）快检方面，虽然已经研发出TTX胶体金快速检测卡，但其灵敏度偏低，无法准确定量，而其他方法无法实现现场快速鉴定；鲀毒鱼物种鉴定方法包括RFLP和PCR技术等，也都无法实现现场快速鉴定，而对于鲀毒鱼辨别或者中毒施救，现场快速鉴定具有重要的意义。2）TTX及其衍生物种类繁多，目前已知的有40多种，且结构相似，有很多尚无标准品，而标准品是保证准确定量、结果具有可比性的重要物质基础；3）虽然利用DNA条形码测序技术可以对所有鲀毒鱼的物种进行鉴定，但利用qPCR等快速方法开展的鲀毒鱼鉴定种类研究还很少，亟需针对更多有毒物种开发快速鉴定方法。

为了解决上述问题，还需要开展多方面研究：1）需明确鲀毒鱼毒素的产生机制及影响因素，掌握毒素与养殖环境、生长季节、生长周期、不同部位以及体内环境微生物的关系，确定毒素的生成分布规律，为准确检测和判定鲀毒鱼毒性提供指导。2）研究TTX及其衍生物合成技术，克服难以分离或者分离量少的问题，并解决缺乏标准品导致的无法定量的困难。3）针对更多鲀毒鱼物种进行毒性研究，确定不同物种与毒性的关系，并针对有毒物种开发物种鉴定方法，同时根据种属毒性关系，分别开发属通用或种特异的鲀毒鱼快速鉴定方法。4）目前还缺乏TTX现场快速定量检测方法，在现有胶体金检测卡基础上，开发基于荧光标记的检测卡同时配套读卡仪，可以实现鲀毒素的现场快速定量。针对鲀毒鱼的物种快速鉴定，则可以采取环介导等温扩增技术、重组酶聚合酶扩增技术结合微流控芯片等研发提取-扩增-检测一体的鲀毒鱼现场快速鉴定试剂盒。这些研究既能有效防止鲀毒鱼流入市场，预防食品欺诈、标签错误以及健康风险，保障人民生命财产安全，也能进一步推动河鲀市场的合法化发展，更好地开发及利用河鲀资源。