不同粒径超微红茶粉体冷藏特性及降脂功效

涂 政，林家正，褚飞洋，叶 阳

（中国农业科学院茶叶研究所，浙江 杭州 310008）

茶为全世界消费者竞相推崇，是最受欢迎的无酒精饮料之一[1]。茶不仅香气怡人、滋味爽口，还含有以茶多酚为主的多种生物活性成分，具有减肥[2]、降脂[3]、降血糖[4]、抗衰老[5-6]、抗癌[7]等诸多生理功能。由于受茶叶特性与传统饮食习惯的影响，我国茶叶目前仍以饮用为主[8]。近年来，随着粉碎技术的提高和消费者对功能食品的追求，超微茶食品的开发与利用已成为研究热点[9]。

超微粉碎是指将物料颗粒粉碎至粒径30 μm（约500 目）以下的一种粉碎技术，根据粉体颗粒的大小可分为微米级粉碎（1～100 μm）、亚微米级粉碎（0.1～1.0 μm）和纳米级粉碎（0.001～0.100 μm）[10]。与传统粉碎相比，经超微粉碎技术制得的超微粉体具有更好的物理特性、更佳的风味和口感，以及更高的生物利用率与活性。例如，超微粉碎处理可增加超微红茶粉体的分散稳定性[11]，提高脱脂大豆粉的甜度并降低其苦味和粗糙度[12]，提升杨桃和橙皮果渣中不溶性膳食纤维的降胆固醇能力[13]等。

目前，基于茶超微粉体的研究逐渐受到关注。张惠等研究发现茶叶超微粉体粒径与理化特性存在非线性关系，并非粒径越小理化特性越好[14]。黄梅华等比较了普通、超微和纳米粒径下金花茶茶花的物理特性，结果表明3 种粒径下金花茶茶花粉体特性各不相同，其中以超微粉体的生物利用度最高[15]。此外，王敬涵研究发现，1 200 目茶叶超微粉体1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）自由基清除率在反应16 min时显著高于30～800 目粉体，但在反应30 min和60 min时DPPH自由基清除率与800 目粉体差异不显著[16]。不同粒径茶超微粉体与生理功效的关系仍有待阐明。另一方面，茶叶超微粉体在冷藏期间因氧化作用等会改变原有内含成分组成[17]，不同超微粉体粒径是否引起冷藏后化学成分含量的差异，从而导致相应生理功效出现差异尚不清楚，这在茶叶超微粉体加工及应用上具有重要意义。

为探究不同粒径超微红茶粉体冷藏特性及其对降脂功效的影响，本实验以1～30 μm超微红茶粉体为对象，分析了粒径26.116 μm（约600 目）、9.612 μm（约1 600目）和4.338 μm（约3 600目）超微红茶粉体在4 ℃下冷藏180 d（半货架期[18]）后主要内含成分变化和对肥胖大鼠降脂效果的影响差异，以期为茶叶超微粉体加工及高值化利用提供理论参考。

1 材料与方法

1.1 动物、材料与试剂

SD大鼠（SPF级，雄性，合格证号：1707030005，由浙江省实验动物中心提供，实验动物生产许可证号：SCXK（浙）2014-0001，实验动物使用许可证号：SYXK（浙）2013-0188，初始体质量：（180±10）g）；基础饲料由浙江省实验动物中心饲料生产基地供应；高脂饲料在基础饲料中添加20.0%（以基础饲料质量计，下同）蔗糖、15%猪油、1.2%胆固醇、0.2%胆酸钠、4%酪蛋白、适量磷酸氢钙、适量石粉等，除了粗脂肪外，高脂饲料的水分、粗蛋白、粗脂肪、粗纤维、粗灰分、钙、磷、钙、磷含量均达到GB/T 13078—2017《饲料卫生标准》要求；动物饮水为净水器过滤后的城市自来水，装入消毒过的饮水瓶内以供自由饮用；大鼠全价营养颗粒饲料由浙江省实验动物中心饲料生产基地供应。

超微红茶粉体为实验室自制。采用一芽一叶鸠坑种茶树鲜叶经萎凋-揉捻-发酵-干燥工序制得毛茶，再由南京大学雨润集团纳米科技工程中心采用气流粉碎技术加工而成。

乙酸钠溶液 上海研恬生物科技有限公司；胃蛋白酶、胰蛋白酶、胰脂肪酶 美国Sigma-Aldrich公司；甘油三酯、猪胆盐 北京索莱宝科技有限公司；4-硝基苯基月桂酸酯 北京沃凯生物科技有限公司；游离脂肪酸测定试剂盒 北京盒子生工科技有限公司；总胆固醇（total cholesterol，TC）测定试剂盒、甘油三酯（triglycerides，TG）测定试剂盒、高密度脂蛋白胆固醇（high-density lipoprotein cholesterol，HDL-C）测定试剂盒、低密度脂蛋白胆固醇（low-density lipoprotein cholesterol，LDL-C）测定试剂盒 德国DiaSys Diagnostic Systems GmbH公司；胆固醇（纯度97%）、胆酸钠（纯度99%）山东西亚化学工业有限公司；酪蛋白（食品级） 郑州天海生物科技有限公司。

1.2 仪器与设备

HQM-10纤维剪切粉碎机 江苏华强纳米科技有限公司；UV-3600型紫外-可见分光光度计 日本岛津株式会社；2695高效液相色谱仪 美国Waters公司；7020型全自动生化分析仪 日本日立株式会社；YJ501S型超级恒温水槽 上海跃进医疗器械厂；L-550型离心机 长沙湘仪离心机仪器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 红茶粉的制作

在40 ℃环境下采用HQM-10纤维剪切粉碎机（将毛茶粉碎20、60、300 min，分别获得平均粒径为26.116 μm（约600 目，记为T1）、9.612 μm（约1 600 目，记为T2）和4.338 μm（约3 600 目，记为T3）的超微红茶粉体（粒径委托南京理工大学国家特种超细粉体工程技术研究中心测定），并采用铝箔袋密封，在4 ℃干燥冰柜中存放180 d。

1.3.2 红茶粉内含成分测定

茶多酚、儿茶素质量分数采用GB/T 8313—2018《茶叶中茶多酚和儿茶素类含量的检测方法》测定；水分质量分数采用GB/T 8304—2013《茶 水分测定》测定；游离氨基酸质量分数采用GB/T 8314—2013《茶 游离氨基酸总量的测定》测定；粗纤维质量分数采用GB/T 8310—2013《茶 粗纤维的测定》测定；可溶性糖质量分数采用蒽酮-硫酸比色法测定[19]；茶黄素、茶红素、茶褐素质量分数参照Roberts等的方法[20]测定。结果均以干质量计。

1.3.3 不同粒径超微红茶粉体对脂质分解影响的研究

参照Cha等的方法[21]研究不同粒径超微红茶粉体对脂质分解的影响。模拟胃液的配制：将3.2 g胃蛋白酶、2 g氯化钠和7 mL浓盐酸（360 g/L）溶解到1 L 水中，用0.1 mol/L盐酸将pH值调到1.2±0.1；模拟肠液的配制：将6.8 g磷酸二氢钾和77 mL氢氧化钠（0.2 mol/L）、10 g胰脂肪酶、0.05 g猪胆盐溶解到750 mL水中，用0.2 mol/L氢氧化钠溶液将pH值调到7.2±0.1。模拟胃液和模拟肠液用0.45 μm膜过滤后，于4 ℃保存备用。将26.116、9.612 μm和4.338 μm粒径超微红茶粉体分别置于盛有10 mL模拟胃液的锥形瓶中，加入60 μL甘油三酯，然后使其在37 ℃、95 r/min的摇床上振荡，2 h后，将36 mL模拟肠液加入锥形瓶中，用0.2 mol/L氢氧化钠溶液将pH值调到7.2±0.1，继续在37 ℃、95 r/min摇床上振荡，分别在60 min和120 min时取样，与未添加茶粉的样品作为对照。游离脂肪酸浓度测定按照试剂盒说明书进行。

1.3.4 胰脂肪酶活性抑制率测定

胰脂肪酶活性抑制率测定参照McDougall等的方法[22]并略作修改。试管中加入Tris缓冲液（pH 8.2、0.1 mol/L）400 μL、胰脂肪酶（50 U/mL）150 μL、不同质量浓度（20、50、100、200、400、800 μg/mL）超微红茶粉体溶液100 μL，37 ℃条件下预热10 min后加入450 μL 0.08 g/100 mL 4-硝基苯基月桂酸酯底物，混匀，在37 ℃条件下避光反应30 min，16 000 r/min离心3 min，于405 nm波长处测定上清液的吸光度（A）。对照组将样品溶液替换成Tris缓冲液（A1）；对照空白组将胰脂肪酶和样品溶液替换成Tris缓冲液（A2）；样品空白组为不加酶的样品溶液（A3），对胰脂肪酶活性抑制率按下式计算。

1.3.5 动物实验

雄性SD大鼠饲养于清洁级动物房内（温度18～26 ℃、相对湿度50%～60%、光照明暗交替各12 h、通风22 次/h），将大鼠分为对照组（CK）和肥胖模型组，分别喂养基础饲料和高脂饲料，饲养14 d后建立肥胖大鼠模型，将诱导成功的肥胖大鼠（定义为比对照组平均体质量增加20%的大鼠[23]）再随机分为4 组：HFD组、26.116 μm粉体组（T1）、9.612 μm粉体组（T2）和4.338 μm粉体组（T3），每组10 只，大鼠继续按照初期饲喂方式喂养35 d，将4 ℃下密封冷藏180 d后的超微红茶粉体经沸腾蒸馏水溶解后制成粉体悬浮液，冷却后进行灌胃（给药剂量为300 mg/kgmb，给药体积为1 mL/100 g），对照组和肥胖模型组给予等体积生理盐水，每天灌胃1 次，每隔7 d称质量，35 d后不禁食采血测定大鼠血清TC、TG、LDL-C和HDL-C浓度，具体测定方法参照试剂盒说明书进行。

1.4 数据统计分析

采用SPSS 16.0软件进行单因素方差分析中的LSD差异显著性分析和Pearson相关性分析，作图采用R语言和Origin 8.0软件。样品检测重复3 次，结果以平均值±标准差表示。

2 结果与分析

2.1 不同粒径超微红茶粉体冷藏前后的内含成分变化

如图1A所示，T1粗纤维质量分数为9.32%，显著高于T2（8.36%）和T3（8.25%）（P＜0.05）；其他内含成分质量分数呈T1、T2、T3逐渐增大趋势，但无显著性差异；表明超微红茶粉体粒径越小，内含成分浸出率越高，但在600～3 600 目内差异不显著。由图1B可知，冷藏后，T2、T3的粗纤维质量分数差异不显著，T1茶多酚和茶红素质量分数分别为18.17%和11.82%，显著高于T2（分别为17.36%和10.76%）和T3（分别为16.93%和10.42%）（P＜0.05），茶褐素质量分数为3.96%，显著低于T2（4.67%）和T3（4.89%）（P＜0.05），T2和T3之间各物质质量分数差异不显著；各粒径间茶黄素和可溶性糖质量分数差异不显著；表明在冷藏过程中茶多酚和茶红素质量分数随着粉体粒径减小而加速减少，而茶褐素质量分数随粉体粒径减小而加速增加。研究表明，水分含量是引起茶叶粉体化学特性改变的重要因子，在冷藏过程中与茶多酚等内含成分含量呈显著负相关[18]。然而，冷藏后T1水分质量分数增加到4.83%，显著高于T2（3.99%）和T3（4.17%）（P＜0.05），表明在600～3 600 目范围内，由含水量差异引起的内含成分变化不明显，可能与粉体物理特征关系较大。T1、T2和T3冷藏后儿茶素组分质量分数如图2所示，各组间儿茶素组分差异不显著（P＞0.05），其中表没食子儿茶素没食子酸酯质量分数最高，分别占茶粉干质量的0.769%、0.736%和0.715%。

图1 不同粒径超微红茶粉体冷藏前后内含成分变化Fig. 1 Changes in contents of chemical compounds in black tea superfine powders with different particle sizes after cold storage

图2 不同粒径超微红茶粉体冷藏后儿茶素质量分数Fig. 2 Changes in catechin contents in black tea superfine powders with different particle sizes after cold storage

2.2 不同粒径超微红茶粉体物理指标及化学指标相关性

26.116 μm（T1）、9.612 μm（T2）和4.338 μm（T3）粒径超微红茶粉体综合物理特性本课题组已有研究报道[24]，如图3所示，膨胀力、持水力和堆密度与超微红茶粉体的粒径之间呈正相关，粒径越大，粉体堆密度、膨胀力和持水力越大；而离散度、休止角和滑角与超微红茶粉体的粒径之间呈负相关，粒径越大，粉体离散度、休止角和滑角越小。对不同粒径超微红茶粉体冷藏后茶多酚、茶红素和茶褐素质量分数的变化量与粉体物理特征参数进行Pearson相关性分析，结果如表1所示，茶多酚、茶红素质量分数减少量与膨胀力、持水力、堆密度呈显著或极显著负相关（P＜0.05、P＜0.01），与离散度、休止角呈显著或极显著正相关（P＜0.05、P＜0.01）；即随着粉体膨胀力、持水力和堆密度增大，离散度、休止角减小，茶多酚和茶红素质量分数减少量越小。茶褐素质量分数增加量与膨胀力、持水力、堆密度呈显著或极显著正相关（P＜0.05、P＜0.01），与离散度、休止角呈显著或极显著负相关（P＜0.05、P＜0.01）；即随着粉体膨胀力、持水力和堆密度增大，离散度、休止角减小，茶褐素质量分数增加量越大。结果表明，在600～3 600 目范围之内，超微红茶粉体粒径越大，其膨胀力、持水力、堆密度越大，离散度、休止角越小，可抑制茶多酚和茶红素质量分数的降低和茶褐素质量分数的增加。因此，在600～3 600 目之间，超微红茶粉体粒径越小，越不利于茶多酚和茶红素含量的保持。

图3 不同粒径超微红茶粉体物理指标分析Fig. 3 Physical properties of black tea superfine powders with different particle sizes

表1 不同粒径超微红茶粉体物理与化学指标Pearson相关性分析Table 1 Pearson correlation analysis between physicochemical properties of black tea superfine powders with different particle sizes

2.3 不同粒径超微红茶粉体对胰脂肪酶活性抑制的影响

胰脂肪酶是脂肪水解过程中的关键酶，抑制脂肪酶的活性能有效抑制脂肪的水解和吸收，从而控制肥胖[25]。不同粒径超微红茶粉体在体外对胰脂肪酶活性抑制作用的影响如图4A所示，随着样品质量浓度的增大，超微红茶粉体的胰脂肪酶活性抑制率逐渐增加，相同质量浓度下不同粒径超微粉体间差异均不显著（P＞0.05）。其中，T1、T2和T3对胰脂肪酶活性抑制率半抑制浓度（half inhibit concentration，IC50）分别为591.521、560.672 μg/mL和572.124 μg/mL。通过模拟胃肠道环境下不同粒径超微红茶粉体对甘油三酯分解的抑制能力进一步探究不同粒径粉体对胰脂肪酶活性抑制影响，由图4B可知，在60 min时，T1、T2和T3组游离脂肪酸浓度分别为0.380、0.360 mmol/L和0.389 mmol/L，与CK组（0.408 mmol/L）差异不显著；随着消化时间延长至120 min时，T1、T2和T3组游离脂肪酸浓度分别上升至0.758、0.770 mmol/L和0.738 mmol/L，显著低于CK组（0.932 mmol/L）（P＜0.05），但T1、T2和T3组之间差异不显著（P＞0.05），表明不同粒径超微红茶粉体对甘油三酯的分解均有抑制作用，然而在600～3 600 目范围内对游离脂肪酸抑制效果差异不显著（P＞0.05）。结果表明，在600～3 600 目范围之内，不同粒径超微红茶粉体在胃中对甘油三酯分解能力和胰脂肪酶活性的抑制作用影响较小。

图4 不同粒径超微红茶粉体对胰脂肪酶活性抑制率的影响Fig. 4 Inhibition rates of pancreatic lipase activity by black tea superfine powders with different particle sizes

2.4 不同粒径超微红茶粉体对大鼠体质量影响

茶叶中多酚类物质可抑制脂肪合成，从而抑制体质量增加，减少肥胖的发生[26]。因此，本实验建立了肥胖大鼠模型，经高脂饲料喂养14 d后，肥胖模型组（243.3 g）大鼠体质量平均增加76.3 g，极显著高于基础饲料饲养的CK组（200.7 g）（P＜0.01），表明肥胖大鼠模型建立成功。将肥胖大鼠随机分成4 组，各组大鼠体质量变化如图5所示，T1、T2、T3组大鼠体质量增长率相较于HFD组有所减缓，持续灌胃28 d后，这3 组大鼠体质量显著低于HFD组（P＜0.05），在灌胃35 d后，HFD组大鼠体质量达到474.2 g，显著高于T1（392.5 g）、T2（396.3 g）和T3（394.6 g）组，而这3 组间大鼠体质量差异不显著；CK组大鼠在连续灌胃期间体质量始终显著低于T1、T2、T3组（P＜0.05、P＜0.01）。结果表明，不同粒径超微红茶粉体均能有效减缓肥胖大鼠体质量增长，但在该粒径范围内不同粒径间粉体对大鼠减肥效果影响差异不明显。

图5 不同粒径超微红茶粉体对大鼠体质量的影响Fig. 5 Effect of black tea superfine powders with different particle sizes on rat body mass

2.5 不同粒径超微红茶粉体对大鼠血脂的影响

通过检测灌胃35 d后大鼠血清TG、TC、HDL-C和LDL-C水平以表征大鼠血脂情况，结果如图6所示。HFD组大鼠TC和LDL-C浓度分别为5.228 mmol/L和4.267 mmol/L，显著高于T1（分别为3.611 mmol/L和3.096 mmol/L）、T2（分别为3.947 mmol/L和3.097 mmol/L）和T3（分别为4.308 mmol/L和3.004 mmol/L）组（P＜0.05），T1、T2和T3组之间差异不显著（P＞0.05），但均显著高于CK组（分别为2.252 mmol/L和0.443 mmol/L）（P＜0.05）。此外，HFD组大鼠TG浓度为2.838 mmol/L，显著高于其他组（P＜0.05），T1（1.941 mmol/L）和T3（2.052 mmol/L）组显著高于CK组（1.507 mmol/L）（P＜0.05），而T2组（1.756 mmol/L）与CK组差异不显著（P＞0.05），T1、T2、T3组之间差异不显著（P＞0.05）；HFD组大鼠HDL-C浓度为1.060 mmol/L，显著低于其他组（P＜0.05），而T1（1.456 mmol/L）、T2（1.268 mmol/L）、T3（1.332 mmol/L）、CK（1.337 mmol/L）组之间差异不显著（P＞0.05）。结果表明，灌胃不同粒径超微红茶粉体悬浮液均能有效抑制大鼠TC、TG、LDL-C水平升高和HDL-C水平降低，但在600～3 600 目范围内粒径的影响差异不显著。

图6 不同粒径超微红茶粉体对大鼠血脂的影响Fig. 6 Effect of black tea superfine powders with different particle sizes on rat blood lipids

3 讨 论

3.1 不同粒径超微红茶粉体冷藏特性

茶叶经超微粉碎后能有效减小粒径并增加生物活性物质溶解度[27]，粗纤维、脂溶性多酚和维生素等无法通过传统饮茶方式摄取的不溶性功能成分可以通过茶粉在食品中的应用得到充分补充[28]。然而，与传统茶叶相比，由于超微粉体粒径减小，比表面积和离散度增大，其更容易和氧接触，在冷藏过程中更容易发生氧化变质[18]。研究结果显示，超微红茶粉体冷藏180 d后化学成分含量与其物理特性存在显著相关性，粉体粒径越小，其膨胀力、持水力和堆密度越低，茶多酚、茶红素含量在冷藏过程中氧化越快，茶褐素含量增加越多，表明粒径减小不利于冷藏过程中茶多酚和茶红素的保留，可能由于超微红茶粉体在冷藏过程中，粉体粒径减小导致比表面积增大，从而引起茶多酚和茶红素与氧气接触更加充分，导致非生物氧化加剧，形成氧化程度更高的茶褐素[29-30]。此外，600 目超微红茶粉体水分质量分数为4.83%，显著高于1 600 目和3 600 目超微红茶粉体，这可能是粉体粒径减小、比表面积增大、内部物质暴露所引起[14]。水分含量是评价茶叶货架期的重要指标，刘政权等[18]认为6%为冷藏抹茶的水分质量分数临界点，说明超微红茶粉体粒径越小，持水能力越弱，越有利于冷藏。

3.2 不同粒径超微红茶粉体的降脂功效

Cha等研究发现，茶多酚中表没食子儿茶素没食子酸酯对胰脂肪酶活性的体外抑制效果最好[21]。结果显示，冷藏后600、1 600 目和3 600 目超微红茶粉体间各儿茶素组分含量差异不显著。超微红茶粉体冷藏特性分析结果表明，粒径越大，越有利于防止茶多酚、茶红素质量分数在冷藏过程中的减少以及茶褐素质量分数的增加，而这些多酚类物质均具有降脂减肥的生理活性功能。例如，茶多酚可提高脂肪分解酶活性，促进胆汁分泌，加速脂肪水解，减轻体质量[31-32]；Jafari等通过茶红素灌胃高脂大鼠实验发现，茶红素能够加快酸性甾体排泄来减少肝脏脂质积累[33]；茶褐素可显著调节高脂血症大鼠血脂水平并抑制脂肪肝生成[34-35]，推测这是引起600～3 600 目超微红茶粉体之间对大鼠减重降脂效果差异不明显的原因之一。此外，茶叶中含有丰富的膳食纤维，可以调节肠道菌群，改善脂质代谢[36-37]。研究结果显示，600 目超微红茶粉体粗纤维质量分数在冷藏前后均显著高于1 600 目和3 600 目超微红茶粉体，可能是超微粉碎加剧了茶叶纤维素、半纤维素和木质素等降解为可溶性组分[38]。相对于传统茶叶，这部分功能成分在超微茶粉中得到了有效利用。

综上所述，600～3 600 目超微红茶粉体在冷藏过程中，粒径越大越有利于茶多酚和茶红素的保留，并减缓茶褐素的生成，但对肥胖大鼠降脂功能影响差异不显著。由于减小超微红茶粉体粒径会大大提高生产成本，因此本研究可为超微红茶粉体后续生产及营养利用等方面提供指导。