六经辨证指导下桂枝新加汤治疗颈椎病的网络药理学与分子对接技术作用机制探究

贺美宇，李兆勇，于 澜，杨少锋*

(1.湖南中医药大学，湖南 长沙 410208；2.湖南中医药大学第一附属医院，湖南 长沙 410208)

颈椎病是最常见的脊柱退行性疾病之一，是由于颈椎间盘发生退行性改变累及周围神经、血管、脊髓等组织而出现一系列与影像学改变相一致的临床症状[1]。该病多见于40岁以上的中老年患者，但发病年龄正趋向年轻化[2]，其临床症状与《伤寒论》中的“项强”“身疼痛”“目眩”等相关证候较为相符，六经辨证是《伤寒论》的辨证核心，其六经本质是脏腑经络由表及里发病、转归规律的总结。因此，目前普遍认为《伤寒论》中经方不仅可用于外感热病，也适用于内伤杂病。通过总结多年六经辨证指导下对骨伤科慢性筋骨疾病的诊疗经验，发现慢性筋骨疾病中以太阳病、少阳病、太阴病、少阴病较为常见。其中，部分年老、久病或术后的慢性筋骨疾病患者，因直接或间接耗损气血，致气血不足，筋脉失荣，不荣则痛，筋脉弛缓，发为痿痹；且营卫不和，腠理失司，营气易泄，易感外邪，客于肌表、筋骨、关节，此属太阳营血亏虚证，可治以桂枝新加汤以补气养血、调和营卫、荣养筋脉。施杞教授[3]也认为慢性筋骨疾病以“正气亏虚、外邪侵袭、经络闭阻”为病机特点，应以“调和气血法”为原则，防治慢性筋骨病。

于丽萍[4]运用桂枝新加汤治疗产后身痛，通过将该方加减调和营卫以调理脾胃化生气血，缓解身痛效果明显。毕春和等[5]运用桂枝新加汤结合西医常规方案治疗心绞痛患者，发现较单纯西医常规治疗，心绞痛缓解更为明显，表明桂枝新加汤具有一定的缓解疼痛作用。本研究课题组运用桂枝新加汤加减治疗气血不足证型颈椎病患者，临床疗效也较为明显[6]。不过由于前期研究缺乏现代理论及基础研究的验证，故本研究通过网络药理学探讨桂枝新加汤治疗颈椎病的可能药效成分及潜在靶点，并采用分子对接技术进行对接验证，为今后实验和临床研究提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 桂枝新加汤主要成分的活性成分与作用靶点筛选

应用TCMSP[7](https：//tcmspw.com/tcmsp.php)、BATMAN数据库[8]，分别以“桂枝、白芍、人参、生姜、甘草、大枣”为检索词，按照OB≥30%以及DL≥0.18的限定条件筛选活性成分；通过TCMSP里Related Targets功能与BATMAN关联靶点，按照“Score≥20、 P-value<0.05”的条件筛选药物作用靶点。

1.2 颈椎病的疾病靶点与药物-疾病交集靶点的获取

以“cervical myelopathy”或”cervical spondylosis”为关键词，检索GeneCards(https：//www.genecards.org/)、OMIM(http：/www.omim.org/)、DisGeNET(http：//www.disgenet.org/)、Drugebank(https：//go.drugbank.com/)、CTD[9](http：//ctdbase.org/detail.go?type=disease&acc=MESH%3AD055009)等数据库。删除重复的检索致病靶点，分别将所获得的药物作用靶点和疾病致病靶点输入Uniport数据库(https：// www.uniprot.org/)，筛选物种为“人源(homo sapiens)”，已验证“reviewed”的靶点基因。借助Venny数据库(https：//bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/)获取药物-疾病交集靶点。

1.3 PPI网络构建与分析

将交集靶点导入 STRING Version11.0数据库(https：//string-db.org/)，选择物种为“人类(homo sapiens)”，设置最低相互作用阈值“highest confidence(≥0.9)”。导入 Cytoscape 3.7.1软件构建 PPI 网络图，运用”Network Analyzer”进行拓扑网络分析，根据节点连接度(degree)筛选得到核心靶点。

1.4 KEGG通路和GO富集分析与“药物-活性成分-疾病-交集靶点”网络模型的构建

借助DAVID(https：//david.ncifcrf.gov/)数据库，设定阈值P<0.05进行GO富集分析；通过KEGG Mapper(https：//www.kegg.jp/kegg/tool/map_pathway2.html)数据库预测相关信号通路；运用R软件绘制气泡图和柱状图。运用Cytoscape 3.7.1软件构建“药物-活性成分-疾病-靶点”网络模型图。

1.5 分子对接验证

从PDB数据库(http：//www.rcsb.org/)中下载筛选的靶点蛋白结构文件，利用PyMol 1.8软件去除水分子并摘取出自身配体，分别保存为*qdb格式文件。通过PubChem(https：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)中下载活性成分3D结构。将靶点蛋白导入 Autodock Tools 1.5.6 软件中，加氢，计算总电荷，设置原子类型，保存为*pdbqt格式文件；运用Autodock Tools软件将配体分子设置可旋转键后保存为*pdbqt格式文件。运行Vina对接，Grid box为原配体中心的周围所有氨基酸残基，选择刚性对接，按照每个配体与受体对接的最优结合能进行排序，选取结合能最小的对接构象导出*pdbqt格式文件，最后运用PyMol 软件将对接构象绘制成可视化模型。

2 结果

2.1 桂枝新加汤活性成分、作用靶点与颈椎病疾病靶点

共筛选出434个活性成分、2 050个潜在作用靶点；选取degree值排名前15的活性成分，详细信息见表1。通过GeneCards、OMIM、Drugebank、DisGeNET、CTD数据库，检索到疾病靶点分别为549、3、24、12、687个，删除重复检索的靶点，排除非人源靶点，共筛选获取到976个疾病靶点。

表1 degree值排名前15的活性成分的基本信息

2.2 交集靶点集与Venny图

通过Venny数据库获得桂枝新加汤与颈椎病的交集靶点143个，见图1。导出交集靶点集数据，通过Uniprot数据库查询其Uniprot ID，以便后续进行GO、KEGG分析。

图1 degree值排名前15的活性成分的基本信息

2.3 PPI网络构建

网络中节点数143个，线条数272条，平均节点degree值3.8；选取BC >中位数0.004 871 63、CC>中位数0.368 421 05、degree>2倍中位数的靶点蛋白，包括PIK3CA、STAT3等10个蛋白，提示其在PPI网络中占有重要地位。蛋白拓扑学性质见表2，PPI网络见图2。

表2 10个核心靶点蛋白拓扑学性质

图2 桂枝新加汤交集靶点蛋白PPI网络

2.4 KEGG分析和 GO 富集分析

应用R语言对共同靶点进行GO分析，主要涉及对脂多糖的反应、对细菌病原体的反应、上皮细胞增殖等过程。获得247条预测的信号通路，排除广泛的信号通路，MAPK、PI3K-Akt信号通路等富集值较高，见图3、图4。

注：MF(1)，BP(2)，CC(3)，KEGG(4)。

注：黄色倒三角形为桂枝新加汤，绿色矩形为药物共有活性成分，浅绿色三角形为药味，蓝色六边形为活性成分，红色圆形为核心靶点，深红色菱形为颈椎病。

2.5 分子对接结果分析

选取活性成分与PPI选取的靶点蛋白进行对接，蛋白及自身配体信息见表3。

表3 参与分子对接的受体蛋白信息

以两两对接的结合能制表，见表4。其中横坐标为靶点蛋白，纵坐标为活性成分，热图中颜色越深表示结合能越小。最低结合能<-5.0 kJ·mol-1即表明药效分子与蛋白对接效果良好，结合能越低，表明分子与蛋白结合能力越佳。结果表明，绝大部分结合能>-5.0 kJ·mol-1，表示结合能力较弱，对接效果不佳。同时发现Betulin与10个靶点蛋白对接结合能均<-5.0 kJ·mol-1。Stigmasterol除了与STAT3外，其余结合能均<-5.0 kJ·mol-1。并且Betulin与ESR1，Betulin、Quercetin、Shyobunone、Stigmasterol与FGF23，Betulin与IL-1B 靶点的结合能值均低于原配体，提示可能为发挥药效作用的关键活性成分，分别绘制8个最低结合能的“药效成分-靶点”对接结合模型，见图5。

表4 桂枝新加汤活性成分与核心靶点蛋白对接结合能信息

图5 “药效成分-靶点”结合模型

3 讨论

目前颈椎病的治疗可分为手术治疗和保守治疗两种方式，在脊髓型颈椎病确诊时，原则上应尽早手术；其余各型颈椎病以保守治疗为首选治疗方案[1]，中医药在保守治疗中占据重要地位。本研究根据课题组专家运用六经辨证理论体系治疗慢性筋骨疾病的诊疗思路，借用网络药理学对桂枝新加汤活性成分-作用靶点与颈椎病致病靶点之间冗杂的网络关联进行分析，明确了Betulin、Stigmasterol等15个活性成分与PIK3CA、STAT3、TP53、IL-6、TNF、MAPK14等10个核心作用靶点；其中Betulin和Stigmasterol不仅为degree值最高的两个活性成分，同时从分子对接的角度验证了其对接能力。研究表明，Betulin具有五环三萜类化合物的抗炎、抗菌、抗病毒等活性[10]。傅增辉等[11]通过细胞实验，发现Betulin对β淀粉样蛋白(Aβ)诱导的小鼠小胶质细胞的炎症反应有明显抑制作用。Stigmasterol可通过下调NF-κB p65和p38MAPK的表达，显著抑制促炎介质(TNF-β、IL-6、IL-1、iNOS和COX-2)的表达，增加抗炎细胞因子(IL-10)的表达[12]。GABAY等[13]通过Stigmasterol干预IL-1β刺激培养下的人骨关节炎软骨细胞和新生小鼠软骨细胞，发现Stigmasterol能抑制诱导OA软骨的促炎和基质降解介质。

本研究通过分子对接模拟，发现MAPK14(p38-α)与Betulin、Shyobunone、Stigmasterol、Sylvestrene结合效果较好，提示桂枝新加汤缓解颈椎病疼痛可能与丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activatedproteink-inase，MAPK)信号通路密切相关。MAPK信号通路参与了细胞的基因表达、增殖、分化、迁移、凋亡和新陈代谢等多种功能[14]。哺乳动物中至少有四组MAPK，p38 MAP激酶(MAPK)参与一个信号级联，是MAPK家族控制炎症反应最重要的成员。p38MAPK通路是促炎性细胞因子在生物转录和翻译水平上合成的关键调控通路[15]，主要被促炎因子、应激刺激、脂多糖、蛋白合成抑制剂、细菌病原体及其产物等激活[16]。大量研究指出p38MAPK也参与椎间盘退变过程中炎症因子的表达，与椎间盘退变程度呈正相关；抑制p38MAPK的激活，能减少外界炎症刺激下椎间盘炎症的表达[17]。TOSHINORI等[18]在神经鞘内应用特异性阻断p38MAPK活性的抑制剂SB203580，发现能够减少LDH患者的触诱发痛。因此，LIN等[19]提出特异性靶向p38MAPK分子及其信号通路是治疗疼痛的潜在策略，并且一些天然产物和生物成分也可能成为潜在p38MAPK抑制剂。

本研究通过网络药理学分析桂枝新加汤可能是通过影响p38 MAPK信号通路抑制颈椎退变椎间盘中炎症反应，从而发挥缓解颈椎病身疼痛的作用。然而网络药理学的研究是基于生物信息网络理论、数据库、算法等基础上预测出来的结果[20]，其真实性仍需进一步的实验验证。运用桂枝新加汤治疗颈椎病，只是六经辨证指导下经方治疗慢性疾病的一部分内容，本研究为临床六经辨证理论体系应用于慢性筋骨疾病的诊治，提供了新的思路。