建立高效液相色谱法指纹图谱分析方法评价五味子药材质量

王艳红，张任男，王缨，历娜，沈振铎

1.山东药品食品职业学院，山东 威海 264210；2.山东博安生物技术有限公司，山东 烟台 264670

五味子为木兰科植物五味子的干燥成熟果实。习称“北五味子”。研究表明，五味子中木脂素类成分为主要的活性成分［1-3］，起到保肝、抗氧化等药理作用。五味子为临床常用中药，收录于《中国药典》（2020 年版）一部［4］。目前五味子质量标准尚存在诸多不足，特别是指标成分较为单一。中药化学成分的复杂性和多样性是其发挥疗效的基础，亦是评价药材质量的重点和难点［5］。中药材色谱指纹图谱可以从整体上反应药材全貌和主要化学成分的特征；可评价中药材间的质量差异，用于综合判断中药材质量。目前，五味子指纹图谱多采用高效液相色谱法（HPLC）、超高效液相色谱法（UPLC）［6-11］等，但当前的色谱方法对主要成分的分离效果参差不齐，且对药材评价手段未达成共识。因此，本研究建立了五味子药材的HPLC 指纹图谱及多指标成分指认，通过聚类分析建立相似度模型，综合判断五味子药材质量，为五味子中药材质量控制提供支持。

1 仪器与试药

1.1 仪器

Agilent 1100 高效液相色谱仪；CPA225D 电子天平（赛多利斯公司）；XSE205 十万分之一天平（梅特勒托利多仪器有限公司）；HH-6 电热数显恒温水浴锅（上海拓赫机电科技有限公司）。

1.2 试药

标准化合物五味子醇甲、戈米辛-D、戈米辛-J、五味子醇乙、前戈米辛、当归酰戈米辛H、五味子酯甲、巴豆酰戈米辛-P、戈米辛-E、五味子甲素、戈米辛-N、五味子乙素和五味子丙素均由沈阳药科大学药物分析实验室从五味子中分离得到，并用TLC、HPLC 方法确认其性质和纯度，纯度均在95%以上。甲醇（色谱纯，Merk）、乙腈（色谱纯，Merk）；超纯水自制。本研究共自采了14 批不同产地五味子药材，见表1，经沈阳药科大学中药学院孙启时教授鉴定为木兰科植物五味子Schisandra chinensis（Turcz.）Baill 的干燥成熟果实，药材粉碎后过 40 目筛，粉末置干燥器中于阴凉处密闭储存。

表1 五味子药材来源

2 方法与结果

2.1 分析条件

色谱柱：Phenomenex Luna C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流动相：水（A）-乙腈（B），梯度洗脱：0～20 min，55%A →35%A；20～26 min，35%A；26～50 min，35%A →25%A，柱温：30 ℃；流速：0.8 mL/min；检测波长：220 nm；进样量：5 μL。

2.2 溶液的配制

2.2.1 对照品溶液的配制 分别取木脂素类对照品五味子醇甲（Schi）、戈米辛-D（GD）、戈米辛-J（GJ）、五味子醇乙（Aom）、前戈米辛（Pre-G）、当归酰戈米辛H（Ange）、五味子酯甲（Schi-A）、巴豆酰戈米辛-P（Tig）、戈米辛-E（GE）、五味子甲素（Deoschi）、戈米辛-N（GN）、五味子乙素（γ-schi）和五味子丙素（Schi-C）对照品适量，精密称定，置10 mL 容量瓶，加入适量甲醇溶解，并继续用甲醇定容即得，使Schi、GD、GJ、Aom、Pre-G、Ange、Schi-A、Tig、GE、Deo-schi、GN、γ-schi 和Schi-C各成分浓度依次为2.0，1.0，1.0，2.0，1.0，1.0，1.0，1.0，1.0，1.0，1.0，1.0 和1.0 mg/mL，2～8 ℃于药品储存柜保存。

2.2.2 供试品溶液的配制 取药材粉末500 mg，精密称定，置25 mL 容量瓶中，加入色谱甲醇约20.0 mL，超声波提取20 min，甲醇定容至刻度，混匀，0.45 μm 滤膜滤过，弃去初滤液，取续滤液分析。

2.3 精密度试验

取药材（5）粉末约500 mg，精密称定，按“2.2.2供试品溶液的配制”项下操作，按“2.1 色谱条件”项下连续进样6 次。结果显示，主要成分色谱峰的相对保留时间（RRT）的RSD 小于0.2%，相对峰面积（RA）的RSD 小于0.6%，精密度良好。

2.4 重复性试验

取药材（5）粉末约500 mg，精密称定，按“2.2.2供试品溶液的配制”项下操作，平行制备5 份供试品溶液，按“2.1 色谱条件”检测分析。结果显示，主要成分色谱峰的RRT 的RSD 小于0.9%，RA 的RSD小于4.2%，方法重复性良好。

2.5 稳定性试验

取五味子药材（5）约500 mg，精密称定，按“2.2.2供试品溶液的配制”项下操作，分别在0、2、4、8、12 和24 h 时间点检测分析，结果显示，主要成分色谱峰的RRT 的RSD 小于0.9%，RA 的RSD 小于3.4%，说明供试品在24 h 内稳定。

2.6 五味子HPLC 色谱指纹图谱共有模式的建立

内参比峰选择：选择位于保留时间中间位置的Tig（8 号峰）为内参比峰。14 批五味子共确定了13 个共有峰，并且对13 个共有峰进行了指认。图谱见图1。

图1 五味子HPLC指纹图谱：A.对照品；B.样品

2.7 五味子药材色谱指纹图谱

测定了14 批样品，以各色谱峰的RRT 定性，按下式计算各色谱峰面积相对其称样量的比值，数据见表2。HPLC 指纹图谱见图2。

图2 14批五味子HPLC指纹图谱

表2 14批五味子指纹图谱中13个指认成分的相对峰面积

注：Xn表示第n个样品的某个组分的峰面积与称样量的比值，若某一样品在指定位置未检测到色谱峰，则Xn为零；An表示第n个样品相应组分的峰面积；Wn表示第n个样品的称样量。

2.8 五味子HPLC 指纹图谱质量鉴定

2.8.1 基于SPSS 的聚类分析 将表2 数据代入SPSS 软件对其进行聚类分析，采用组间（between groups）链锁法，以欧氏距离（euclidean distance）为测度。结果显示，14 批五味子样品被划分为两类，结合外观形态，可判定第I 类为推荐品，第Ⅱ类为一般品。聚类谱系图见图3。聚类分析结果：1、2、3、4、5、6、7、8、10、11、12、13、14 号样品为第I 类，9 号样品为第Ⅱ类。

图3 五味子聚类谱系图

2.8.2 共有模式建立 采用国家药典委员会“中药色谱指纹图谱相似度评价系统”处理软件，选取第I类13 批推荐品建立共有模式。

2.8.3 五味子样品相似度计算 以建立的共有模式为标准，计算各批药材与共有模式间的相似度，结果见表3。

表3 14批五味子相似度分析结果

若样品与共有模式间的相似度在0.90 以上，则为推荐药材。若样品与共有模式间的相似度在0.90以下则为非推荐药材。实验结果表明，9 号产地五味子为非推荐药材，其他产地五味子均为推荐药材。

3 讨论

3.1 色谱柱选择

本文对三种不同的色谱柱（Luna C18、Elite-Hpersil ODS、Diamonsil C18）进行了研究，Luna C18 色谱柱分离效果最佳。

3.2 检测波长选择

考察了218、220、240、254 和280 nm 波长下的色谱图。结果表明，在木脂素最大吸收波长220 nm处色谱响应最佳。

3.3 流动相选择

分别考察甲醇-水、乙腈-水流动相系统。结果显示，乙腈-水组成的体系能将所有组分基线分离。

3.4 提取条件选择

本研究对提取方法、提取溶剂、提取时间和溶剂量对提取效果的影响进行了研究。比较回流提取和超声提取两种方法，结果表明，超声提取具有提取效率高、方便、耗时短等优点，因此，选择了超声提取方式。考察以正己烷、氯仿、无水乙醇、乙醇-水（75∶25）、乙醇-水（95∶5）和甲醇为提取溶剂，其中乙醇-水（75∶25）、乙醇-水（95∶5）和甲醇的提取效率较高。为了方便起见，选择甲醇为提取溶剂。考察提取时间：10、20、30、40、50 和60 min。考察溶剂倍量：20、30、40、60 和80 倍。结果表明，在其他条件不变的情况下，提取时间大于20 min 或溶剂倍量大于30 的组分变化不显著。因此，提取时间选择20 min，提取溶剂倍量大于30。

3.5 小结

本研究采用HPLC 法建立五味子药材的指纹图谱。选择13 个响应较高且分离度较好的木脂素类成分作为共有特征峰，建立共有模式，采用国家药典委员会“中药色谱指纹图谱相似度评价系统”处理软件评价药材质量，结果显示，除9 号产地药材外均为推荐品，本研究思路为五味子中药材的质量控制提供了方法学上的参考，可用于判断和鉴别五味子药材的质量。