HPLC 法测定酒升麻饮片中异阿魏酸的含量

佘永红，杨德泉，吉林芳

湘西土家族苗族自治州食品药品检验所，湖南 吉首 416000

升麻为毛茛科植物大三叶升麻Cimicifuga heracleifoliaKom.、兴安升麻Cimicifuga dahurica（Turcz.）Maxim.或升麻Cimicifuga foetidaL.的干燥根茎。升麻用药历史悠久，《太平惠民和剂局方》中收载的升麻葛根汤，升麻为方中君药，配伍芍药、葛根、甘草，主治麻疹不透。李时珍曰［1］：“升麻引阳明清气上升，柴胡引少阳清气上升。”李杲的千古名方补中益气丸，方中以升麻、柴胡为佐药，诸药合用，补中益气，治疗气虚下陷证。升麻鳖甲汤出自《金匮要略》，治阳毒，具有清热、解毒、散瘀的功效。现代临床研究报道，含有升麻的清胃散常用于治疗牙周炎、慢性胃炎［2-3］；升麻在舌癌、支气管肺癌、直肠癌及宫颈癌等癌症中均有配方使用，升麻鳖甲汤加减可以有效治疗及辅助治疗急性白血病、急性髓系白血病及慢性粒细胞白血病［4-7］；升麻可以缓解围绝经期综合征［8-9］，成分为升麻总皂苷的中成药希明婷片，用于女性围绝经期综合征，临床使用安全有效。

升麻主要含有三萜及其苷类、酚酸类及色原酮类等成分，《中国药典》2020 年版一部［10］未收载酒升麻饮片标准,《湖南省中药饮片炮制规范》2010 年版［11］酒升麻收载在升麻项下，标准仅收载成品性状、鉴别、浸出物等项目，为了保证酒升麻质量的可控，本研究采用HPLC 法研究测定酒升麻中酚酸类活性成分之一的异阿魏酸含量，为酒升麻饮片质量控制提供有效手段。

1 仪器与试药

1.1 仪器

Agilent 1260 高效液相色谱仪，检测器：VWD ；色谱柱：安捷伦ZORBAX SB-C18（250 mm×4.6 mm，5 μm），型号：880975-902，Agilent 公司；岛津电子天平AUW220D，最大量程：82/220 g，称量精度：0.01 mg/0.1 mg；ZOOMWO Water Environmental 超纯水机；DZTW 电子调温电热套。

1.2 试药

异阿魏酸对照品（中国食品药品检定研究院，含量测定用，批号：111698-201904，纯度：99.3%）。甲醇、乙腈为色谱纯；水为纯净水；其他试药均为分析纯。

1.3 样品

18 批酒升麻饮片，由湖南省6 家生产企业各提供3 批（分别为19101806-1、19101806-2、19101806-3、2019090608、2019090609、2019090610、201910109、201910110、201910111、202003242019、202003242020、202003242021、19111605-1、19111605-2、19111605-3、20200501-1、20200501-2、20200501-3），产地分别来自黑龙江、辽宁、内蒙古、四川等。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱：ZORBAX SB-C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；乙腈-0.1%磷酸溶液（13∶87）；流速1.0 mL/min；检测波长为316 nm；柱温30 ℃。理论板数按异阿魏酸峰计算，不低于5 000。

2.2 对照品溶液的制备

取异阿魏酸对照品，精密称定①12.54 mg、②10.67 mg，分别置25 mL 棕色量瓶中，加10%乙醇使溶解并稀释至刻度，摇匀，即得对照品储备液（498.088 8 μg/mL，423.812 4 μg/mL）。精密吸取上述对照品储备液各1 mL，分别置25 mL、20 mL量瓶中，加10%乙醇依次稀释成浓度为19.923 6 μg/mL、21.190 6 μg/mL 的对照品溶液。

2.3 供试品溶液的制备

取样品粉末（过二号筛）约0.5 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入10%乙醇25 mL，密塞，称定重量，加热回流2.5 h，放冷，再称定重量，用10%乙醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

2.4 系统适用性试验

分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10 μL，按上述色谱条件进样，异阿魏酸分离度大于1.5，理论板数均在19 000 以上。供试品色谱中，在与对照品色谱峰相应的位置上检出色谱峰，见图1～3。

图1 异阿魏酸对照品色谱图

图2 异阿魏酸样品色谱图

图3 阴性样品色谱图

2.5 线性关系考察

精密吸取浓度为498.088 8 μg/mL 的对照品储备液适量，依次稀释成浓度为3.984 7 μg/L、12.452 2 μg/mL、19.923 6 μg/mL、24.904 4 μg/mL、49.808 9 μg/mL、99.617 8 μg/mL、149.426 6 μg/mL的对照品溶液，精密吸取上述对照品溶液各10 μL，注入液相色谱仪，测定，以峰面积积分值为纵坐标，进样量（μg）为横坐标，绘制标准曲线。其回归方程为：Y=51.23X+18.352，r=0.999 9。结果表明：异阿魏酸对照品在3.984 7 μg～149.426 6 μg范围内线性关系良好。

2.6 精密度试验

取同一酒升麻供试品溶液（批号19101806-1），连续进样6 次，每次10 μL，记录色谱峰面积，计算RSD（n=6）为0.44%，表明仪器精密度良好。

2.7 稳定性试验

取同一酒升麻供试品溶液（批号19101806-1），分别于配制后的0、2、8、14、24 h，精密吸取10 μL，注入液相色谱仪，测定，异阿魏酸的RSD（n=5）为0.47%，表明供试品溶液在24 h 内稳定。

2.8 重复性试验

取同一酒升麻供试品溶液（批号19101806-1），依法制备6 份供试品溶液，测定并计算，含量分别为0.24%、0.23%、0.23%、0.23%、0.24%、0.23%，RSD%为2.3%，表明该方法重复性良好。

2.9 耐用性试验

采用拟定的方法，使用不同的液相色谱仪、两个不同的色谱柱对同一批样品进行测定，（1）仪器：Agilent 1260 Infinity，检测器VWD；色谱柱：ZORBAX SB-C18（250 mm×4.6 mm，5 µm），型号：880975-902，Agilent 公 司。（2）仪 器：Agilent 1260 Infinity Ⅱ，检测器 DAD；色谱柱：Acclaim™ Polar Advantage IIC18（250 mm×4.6 mm，5 μm），型号：JADE-PAK，Thermo 公司。平行测定同一生产企业3 个批号的样品（2019090608、2019090609、2019090610），结果3 份样品的异阿魏酸含量分别为（1）0.41%、0.38%、0.44%；（2）0.42%、0.38%、0.45%。（1）与（2）测定的3 份含量结果之间的RSD 分别为0.18%、0、0.16%。结果表明，本方法耐用性良好。

2.10 回收率试验

取已测定含量的同一酒升麻样品（批号19101806-1，含异阿魏酸2.331 mg/g）约0.25 g（9份），精密称定，置锥形瓶中，按干燥品计算（水分为8.27%），按80%、100%和120%的水平精密加入浓度为423.812 4 μg/mL 的异阿魏酸对照品适量，见表1，依法制备供试品溶液，测定并计算，结果平均加样回收率为99.9%。

表1 加样回收率试验结果表

2.11 样品含量测定结果

对企业提供的18 批酒升麻样品进行了含量测定，按“2.3”项方法制备供试品溶液，分别按外标两点法计算，结果见表2。

表2 酒升麻中异阿魏酸含量测定结果

3 讨论

3.1 提取方法的选择

酒升麻质地较轻,粉末经过加热回流提取,料液的黏度变小,相比超声提取的方法过滤速度要快，故选择加热回流的提取方法。

3.2 升麻酒炙的现状

升麻始载于《神农本草经》［12］列为“上品”，宋代《宋氏女科秘书》［13］记载了酒炒升麻。归纳《中国药典》《全国中药炮制规范》及各省中药饮片炮制规范标准，有福建、贵州、江西、湖南共4 省中药饮片炮制规范收载了酒升麻的饮片标准,其中湖南、福建2 个省采用单一的酒为辅料炒炙，贵州、江西2 个省采用酒润麸炒的炮制方法，由于酒升麻临床用药经验传承的迭代，酒升麻使用的省份及临床应用受到限制，导致酒升麻炮制工艺得不到统一，质量标准简单，避免酒升麻饮片炮制技术、临床应用经验失传，亟待提升酒升麻的质量标准，让酒升麻在炮制技术、临床用药中得以传承、发展和创新具有重要意义。

3.3 酒炒升麻的炮制作用

有关酒升麻的炮制作用，明代的《医学入门》［14］记载：“发散生用，补中酒炒，止咳升者蜜炙。”清代《本草述钩元》［15］记载：“发散生用，补中酒炒，止咳汗蜜炒，治滞下醋拌炒。”上述记载认为升麻经酒制后可增强升麻补中气的作用，在现代临床运用中，认为酒炙后可缓和寒性，并借酒升提之力引药上行，升麻酒炒后常用于中气下陷、脏器脱垂、崩漏不止等病症，在治疗中常配伍柴胡、黄芪等药物。

3.4 酒升麻含量指标成分的选择

异阿魏酸具有解热、镇痛、消炎的作用［16］，张启发等［17］通过实验得出结论：异阿魏酸下调β-catenin 和c-Myc 的表达，诱导A-498 细胞凋亡，抑制A-498 细胞增殖，是治疗肾癌的潜在候选化合物。本研究选择酒升麻中的异阿魏酸作为含量指标成分，对18 批次酒升麻中异阿魏酸含量进行测定，含量范围在0.22%～0.44%，平均值为0.33%。

本研究参照《中国药典》 2020 年版一部升麻药材含量测定的色谱条件，所建立的酒升麻含量测定方法准确、快速，重现性好，为酒升麻的质量控制提供了有效的检测手段。