乳杆菌有机酸耐受性及发酵果蔬汁性能分析

解 寒，刘瑞山，张晓娟，冯婧仪，柴丽娟，陆震鸣，史劲松，许正宏,*

（1.江南大学生物工程学院，江苏 无锡 214122；2.江南大学 粮食发酵工艺与技术国家工程实验室，江苏 无锡 214122；3.福建绿泉食品有限公司，福建 漳州 363200；4.江南大学药学院，江苏 无锡 214122）

果蔬乳酸菌发酵制品由于其独特的风味和益生性能，受到越来越多的关注。乳酸菌发酵可以利用果蔬原料中的营养成分，积累乳酸、酯类物质等风味化合物，赋予发酵果蔬汁丰富的滋味和香气感官特征[1-3]；同时，还可以增加果蔬汁中的生物活性物质，提高其抗氧化和抗菌等性能[4-6]。与其他发酵制品类似，果蔬发酵用的菌种及其发酵性能决定了发酵过程的可控程度，并影响了发酵产品的风味品质[7-10]，但是很多果蔬原料酸度很高，例如柠檬、百香果等高酸原料中，总酸高达25 g/L，这种高酸的营养条件对乳酸菌的发酵产生了显著抑制[11-13]。有机酸通过被动扩散进入细胞质，进入胞内的有机酸迅速解离，导致胞内pH值快速降低，严重影响了细胞的生理活性[14]。此外，果蔬原料含有的有机酸种类也很丰富，而柠檬酸、苹果酸和酒石酸是最常见的3 种有机酸，其他有机酸包括莽草酸、绿原酸和琥珀酸等也在水果中较常见。不同果蔬原料中，有机酸的组成差异非常显著。不同有机酸由于可电离的氢离子数、电离平衡常数以及各种有机酸参与微生物代谢机制的不同，从而导致原料中有机酸种类对乳杆菌的生长的抑制存在显著差异，因此果蔬原料的发酵需要考虑菌种的耐酸性能，同时还需要选用针对原料有机酸特点的抗逆菌种。在果蔬生物加工领域中，发酵性能好、与原料适配的抗逆菌株是决定乳酸菌果蔬发酵品质的关键。提高乳酸菌果蔬发酵品质，需要充分理解果蔬中不同有机酸对乳酸菌发酵性能的影响，并针对不同的原料主体有机酸类型和含量特点，开发系列针对性耐酸菌种，并个性化建立发酵工艺。

基于果蔬乳酸菌生物加工中存在的上述问题，本研究采用前期实验室乳杆菌菌种库中发酵性能较好的3 株乳酸菌，考察其在添加不同种类和浓度有机酸的MRS（Man Rogosa and Sharpe）培养基中生长性能和发酵特性，比较其对不同有机酸的耐受性能。在此基础上，选择有机酸成分差异显著的12 种典型果蔬汁进行乳酸菌发酵，分析它们发酵前后有机酸组成和含量的变化，以期为不同果蔬原料乳酸菌菌种开发以及个性化工艺理性制定提供可以借鉴的方法。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

1.1.1 菌种与试剂

植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）LP-D、植物乳杆菌（L. plantarum）LP-F、鼠李糖乳杆菌（L.rhamnosus）LR-S均由实验室前期通过传统固态酿造食醋醋醅中筛选得到[15-16]，3 株菌均通过16S rRNA序列测序并在NCBI比对后鉴定得出分类学信息。

苹果浓缩汁16 °Brix、荔枝浓缩汁36 °Brix、水蜜桃浓缩汁28 °Brix、百香果浓缩汁13 °Brix、柠檬浓缩汁（清汁）2 °Brix、青梅浓缩汁（清汁）4 °Brix、猕猴桃浓缩汁（清汁）4 °Brix、红葡萄浓缩汁36 °Brix、橙浓缩汁17 °Brix、枸杞浓缩汁18 °Brix、桑葚浓缩汁（颜色过深白利糖度不可计）由福建绿泉食品有限公司提供；芹菜购自超市。

草酸、酒石酸、奎宁酸、丙酮酸、苹果酸、α-酮戊二酸、乳酸、乙酸、柠檬酸、琥珀酸标准品 美国Solarbio公司。

1.1.2 培养基

MRS培养基：酵母膏5.0 g、牛肉膏10.0 g、葡萄糖20.0 g、硫酸镁0.58 g、无水乙酸钠3.0 g、蛋白胨10.0 g、柠檬酸氢二铵2.0 g、硫酸锰0.25 g，加蒸馏水溶解并定容至1 L，121 ℃灭菌20 min。配制固体MRS培养基时添加琼脂2%。

添加有机酸的培养基：向100 mL MRS培养基中额外添加7 种有机酸（乳酸、柠檬酸、酒石酸、苹果酸、琥珀酸、草酸、奎宁酸）至相应浓度梯度。

1.2 仪器与设备

UV-8000紫外-可见分光光度计 上海精密仪器仪表有限公司；恒温培养箱 江苏环宇科学仪器厂；BKQ-B50高压蒸汽立式灭菌锅 山东博科科学仪器有限公司；TH-YJ-1450A/B型净化工作台 苏州华科净化设备有限公司；PHS-25型pH计 上海雷磁仪器有限公司；SC-3610低速离心机 安徽中科中佳仪器有限公司；1260高效液相色谱仪 美国Agilent公司；Atlantis T3色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 μm） 美国Waters公司。

1.3 方法

1.3.1 菌种活化

将从甘油管拿出的菌株接种到MRS肉汤培养基中，37 ℃恒温厌氧培养20 h。

1.3.2 乳酸菌发酵性能测定

生物量：测定样品在600 nm波长处的OD值；活菌数测定：采用伊红美蓝活菌数快速测定方法；pH值：采用pH计直接测定。

有机酸含量测定：将培养液12 000 r/min离心5 min，取2 mL上清液，分别加入 800 μL 300 g/L硫酸锌溶液和 800 μL 106 g/L亚铁氰化钾溶液振荡混匀，离心，取上清液用0.22 µm微孔滤膜过滤后过 Sep-Pak C18预处理小柱除色素，为待测样品。取1 mL各单标及混标样品过0.22 µm微孔滤膜，为待测标样。处理后的各样品等待高效液相色谱进行有机酸分析。色谱条件：色谱柱为Waters Atlantis T3（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流动相为20 mmol/L NaH2PO4溶液，用磷酸调pH 2.7；进样体积10 μL；洗脱速率0.7 mL/min；分离时间20 min；柱温30 ℃；紫外检测器波长210 nm。测定用的有机酸标准溶液包括草酸、丙酮酸、α-酮戊二酸、酒石酸、奎宁酸、苹果酸、乳酸、乙酸、柠檬酸和琥珀酸10 种常见有机酸，且质量浓度均为0.10 g/L，通过与有机酸标准溶液的保留时间比对定性。定量采用外标法，将有机酸混合标准样品在同样的色谱条件下进样，绘制各种有机酸质量浓度对峰面积的标准曲线。

1.3.3 乳酸菌发酵

将3 株乳酸菌以2%接种量接入MRS培养基中，37 ℃恒温密闭培养20 h（20 h处于稳定期），测定发酵过程中的生物量、活菌数、pH值和有机酸组成及含量。

将3 株乳酸菌以2%接种量接入添加不同质量浓度有机酸的MRS培养基（表1）中，37 ℃恒温密闭培养20 h（20 h处于稳定期），测定发酵后的活菌数和乳酸积累量。

表1 有机酸种类和质量浓度Table 1 Types and concentrations of organic acid

1.3.4 果蔬发酵汁制备

将不同果蔬浓缩汁稀释3 倍（由于浓缩后得到的是果汁清汁，因此白利糖度较低，但是有机酸含量较原果汁浓度显著更高，因此稀释3 倍），和芹菜汁补蔗糖至白利糖度12 °Brix，在105 ℃灭菌5 min，自然冷却，菌种活化3 次后将菌种以2 %的接种量接入果蔬汁中，37 ℃恒温厌氧培养48 h，果蔬浓缩汁处理条件和发酵条件与企业实际生产条件一致。

1.3.5 多菌种复合接力发酵

多菌种接力发酵工艺，例如A→B为接种A发酵至第8小时，让其充分利用营养生长为优势菌，再接入菌种B，两株菌协同发酵至结束。

1.4 数据处理

所有实验均进行3 次生物学重复，采用Graphpad Prism 8进行图表制作，SPSS 20.0进行差异显著性分析，P＜0.05，差异显著。

2 结果与分析

2.1 3 株乳酸菌在MRS培养基中生长和发酵性能的比较

乳酸菌可以使糖类物质发酵产生乳酸等多种有机酸，并且可以增加人体有益菌群、促进营养物质吸收、抗氧化等多种益生功能[17-22]。课题组前期从固态酿造食醋醋醅中分离筛选得到多种乳杆菌，优选了3 株发酵性能较好的乳杆菌进行后续的研究，在MRS培养基中的发酵性能见图1。

图1 3株乳酸菌在MRS培养基中生物量（A）、活菌数（B）、pH值（C）及乳酸、乙酸积累量（D）的变化Fig. 1 Biomass (OD600 nm) (A), viable cell count (B), pH (C) and acetic acid and lactic acid accumulation (D) of three LAB strains cultured in MRS medium as a function of fermentation time

3 株菌生长OD600nm和活菌数的趋势一致，LP-D和LP-F的生长状况较好，16 h后到达稳定期，第20小时OD600nm分别为8.25和7.58，活菌数分别为9.91×109CFU/mL和9.81×109CFU/mL；而LR-S的生长状况略差，第20小时OD600nm仅为3.06，活菌数较LP-D和LP-F低1～2 个数量级。随着菌体生长繁殖和有机酸的积累，发酵前8 h pH值下降迅速，发酵后期，由于乳酸菌进入稳定期，此时pH值下降缓慢直至趋于稳定。根据发酵前后有机酸的分析，3 株乳酸菌均为异型乳酸发酵，产乳酸的同时都产生少量乙酸，其中LP-D在MRS培养基中酸积累能力最强，乳酸积累量为20.4 g/L，乙酸积累量为2.3 g/L；LP-F次之，乳酸积累量为17.2 g/L，乙酸积累量为1.7 g/L；LR-S的酸积累能力最弱，乳酸和乙酸积累量分别只有8.7 g/L和0.2 g/L。

2.2 3 株乳酸菌对7 种有机酸耐受性分析

果蔬原料中富含多种有机酸，如苹果酸在苹果、水蜜桃等水果中含量丰富，通常质量浓度大于10 g/L；柠檬、青梅等果蔬中含有较高的柠檬酸，质量浓度高达15 g/L；而猕猴桃、芹菜中含有较高的酒石酸，质量浓度达到3～5 g/L。因此，考察不同有机酸添加情况下，乳酸菌的发酵生长情况，对发酵工艺和菌种的确定有重要指导意义。本研究选择了果蔬原料中常见的6 种有机酸，此外，由于乳酸是乳酸菌的主要代谢产物，因此也作为待考察的有机酸种类。根据原料中有机酸质量浓度范围，针对性设置了3 个质量浓度梯度（表1），得到不同有机酸对乳酸菌生长和乳酸积累的影响（图2）。

图2 MRS培养基中分别添加不同质量浓度7 种有机酸对乳酸菌生长和乳酸积累量的影响Fig. 2 Influence of different concentrations of seven organic acids in MRS medium on the growth of lactic acid bacteria and the accumulation of lactic acid

考察的有机酸对菌株抑制作用非常明显，不同菌株在同一种有机酸酸胁迫下，生长状况大不相同，体现了果蔬原料可能对乳酸菌造成的抑制作用非常显著，而且由于原料的有机酸组成不尽相同而造成的抑制效果差异显著。LP-D在柠檬酸、琥珀酸和草酸质量浓度分别达到15、4.5 g/L和4.5 g/L时，活菌数有6.9×103、7.4×102、1.9×103CFU/mL，乳酸积累量达到4.2、4.4 g/L和5.6 g/L，而其余2 株菌完全不能生长。LP-F在酒石酸质量浓度4.5 g/L时，活菌数和乳酸积累量分别达到3.6×104CFU/mL和5.3 g/L，而其余两株菌均不生长。LR-S对大多数有机酸的耐受性都较差，然而，在苹果酸和奎宁酸的胁迫下，体现出了较另外两株菌更加优良的抗逆性能。这些结果体现出了不同乳酸菌和不同有机酸之间存在显著的互相选择关系，针对性选择适配抗逆菌种对果蔬发酵非常重要。

2.3 12 种典型果蔬汁中3 株乳酸菌的发酵性能比较

上述结果体现不同菌株对各种有机酸的耐受性能也存在显著差异，因此，准确测定果蔬原料中有机酸的种类和含量对菌种选用以及提升果蔬发酵品质具有重要意义。选择12 种有机酸比较典型的果蔬，将其分为4 类：1）苹果酸为主体酸（苹果汁、荔枝汁和水蜜桃汁）[23-25]；2）柠檬酸为主体酸（百香果汁、柠檬汁和青梅汁）[26-28]；3）酒石酸为主体酸（芹菜汁、猕猴桃汁和红葡萄汁）[29]；4）复合有机酸的果蔬原料（橙汁、桑椹汁和枸杞汁）[30-31]。通过比较不同菌株对这4 类原料的发酵性能，进一步确定针对不同原料的适配性菌种，发酵结果见图3。

图3 12种不同果蔬汁原汁以及分别由3 株乳酸菌发酵后有机酸含量Fig. 3 Organic acid concentrations of 12 fruit and vegetable juices before and after fermentation by three strains of lactic acid bacteria, separately

3 株乳酸菌均是异型乳酸发酵，发酵后的各类果汁中均积累了少量乙酸（均低于0.3 g/L）。苹果酸、柠檬酸、酒石酸和琥珀酸发酵后含量全部下降，这与乳酸菌的代谢特性有关：苹果酸在苹果酸-乳酸酶的催化下发生脱羧反应生成乳酸[32]；柠檬酸可以被乳酸菌利用生成乳酸、乙酸和双乙酰等产物；酒石酸能够被乳酸菌降解生成乳酸和乙酸[33]；琥珀酸在碳代谢途径中，可通过丙酮酸氧化为氢离子和乙酸，也可产生少量乳酸[34]。发酵结束后，上述有机酸有不同程度的降低，而乳酸得到大量积累。乳酸积累量是评价果蔬发酵品质的重要指标[35]，但是同时也需要兼顾其他有机酸的降低情况，例如柠檬酸、苹果酸在原料中的降低，会使发酵后的产品酸感柔和，刺激性减少，这是许多发酵果蔬产品追求的风味特征，科学选择针对性的菌种，可以对这一品质实现有效控制。

图4 3株乳酸菌发酵果蔬后的主体有机酸消耗量以及乳酸积累量Fig. 4 Consumption of major organic acids and lactic acid accumulation in 12 fruit and vegetable juices fermented by three strains of lactic acid bacteria, separately

3 株乳酸菌发酵果蔬后的主体有机酸消耗量以及乳酸积累量见图4。高苹果酸果蔬原料发酵后，苹果酸含量下降了50%～100%，其中LR-S对苹果酸的利用率显著优于（P＜0.05）其余2 株菌，荔枝汁中20.9 g/L的苹果酸甚至被LR-S全部利用完，乳酸积累量也显著高于其余两株菌（P＜0.05）。高柠檬酸果蔬原料中，LP-D对柠檬酸的利用率和乳酸积累量显著优于其余两株菌（P＜0.05），在百香果汁、柠檬汁和青梅汁中乳酸积累量分别有2.2、3.9 g/L和3.6 g/L，而LR-S在百香果汁和青梅汁的高柠檬酸酸胁迫下，甚至不积累乳酸。高酒石酸果蔬原料发酵后，LP-F在芹菜汁和红葡萄汁中对酒石酸的利用率和乳酸积累量显著优于（P＜0.05）其余两株菌。

3 株微生物在果蔬原料发酵的比较结果与在标准MRS培养基中分析得到的3 株微生物对不同有机酸胁迫的响应结果一致。说明菌株对不同有机酸的耐受性能为果蔬原料针对性菌种的选择提供依据。

2.4 双菌顺序接种发酵工艺在复杂有机酸果蔬原料中的应用

上述几种原料均以单一有机酸为主体酸，其他有机酸含量很少或没有。发酵这类原料的关键是选用具有针对性耐受性能的菌株。然而，橙汁、桑葚汁和枸杞汁这类原料，具有1 种以上的主体有机酸，在多重有机酸胁迫下，选择具有不同有机酸耐受性能的菌种，根据对乳酸菌的胁迫来源，理性制定多菌种顺序发酵工艺，利用接种的第1株菌解除/降低胁迫压力，再利用第2株菌高效进行生物转化，理论上较单一菌株发酵更具优势。具体而言，本研究开发的多菌种接力发酵工艺为先将菌株1以1%的接种量接种于果蔬汁中发酵8 h，让其充分利用营养生长为优势菌，消耗掉部分有机酸，减少多重酸胁迫对菌株生长的抑制，再以1%的接种量将菌株2接入果蔬汁中接力发酵直至结束，结果见图5。

图5 双菌顺序接种发酵工艺发酵桑葚汁、橙汁和枸杞汁后主体有机酸消耗量（A）、活菌数（B）和各有机酸含量（C）Fig. 5 Consumption of major organic acids (A), viable bacterial count (B) and organic acid concentrations (C) after the fermentation of mulberry juice, orange juice and Chinese wolfberry juice by sequential inoculation of two strains

从图5可以看出，在橙汁中，前8 h活菌数没有差别，10 h后LP-D→LR-S的活菌数迅速增加，高于其他工艺，在24 h活菌数达到最高2.5×108CFU/mL，其对柠檬酸和苹果酸的利用率也高于其他工艺，乳酸积累量最高，达到6.4 g/L，比LP-D发酵后提高了1.5 倍。这是因为LP-D在苹果酸和柠檬酸的双重酸胁迫下先成为优势菌株，消耗掉部分柠檬酸，减少LR-S面对的柠檬酸酸胁迫，更有利于后续LR-S生长，积累乳酸。桑葚汁中，LP-D→LP-F发酵性能最佳，24 h后活菌数始终高于其他工艺，酒石酸和柠檬酸的消耗量都高于其他组合，乳酸积累量最多，达到5.6 g/L，比LP-D单菌发酵提高了1.4 倍。这是由于在整个发酵过程中LP-D和LP-F充分利用其优势，不断消耗柠檬酸和酒石酸，协同发酵。枸杞汁中，LP-F→LP-D组合在24 h后活菌数高于其他工艺，酒石酸、苹果酸、柠檬酸的消耗量均高于其他工艺，分别消耗了0.5、1.6、4.0 g/L，乳酸积累量也显著高于其他组合，达到5.5 g/L。这是由于在酒石酸、苹果酸和柠檬酸含量都丰富的情况下，先接种LP-F消耗掉较多的柠檬酸，使后续的LP-D能在较温和的条件下发酵，积累乳酸和生物量。因此，分析不同原料的有机酸特点，根据不同菌种的耐受特性，开发个性化的多菌种发酵工艺，是乳酸菌发酵果蔬的高效策略。

3 结 论

本研究发现，不同乳酸菌对各类有机酸耐受性具有显著差异，因此需要选用针对性的抗逆菌种进行发酵。其中LP-D对乳酸、柠檬酸、琥珀酸和草酸的耐受性更好，LP-F在酒石酸的酸胁迫下生长得更好，而LR-S更耐受苹果酸和奎宁酸的酸胁迫；在12 种典型有机酸果蔬中，LP-D、LP-F和LR-S分别适用于高柠檬酸、高酒石酸和高苹果酸类的果蔬原料，这些特性与菌种在MRS培养基中有机酸耐受性能一致。但在橙汁、桑葚汁和枸杞汁这类有机酸复杂果蔬汁中，单一菌种由于耐受性能不全面导致发酵程度不高。针对橙汁、桑葚汁和枸杞汁这类有机酸复杂果蔬汁建立了双菌顺序接种发酵工艺，分别是LP-D→LR-S、LP-D→LP-F、LP-F→LP-D组合的发酵特性最佳，体现了复合菌种对多重有机酸的抗胁迫能力更强。本研究建立基于菌种耐受性分析的发酵菌种选择策略以及双菌顺序接种发酵工艺，对提高果蔬发酵产品品质以及发酵过程的控制提供了参考。