漆酶催化二氢杨梅素氧化聚合

刘晓玲，何承云，陈春刚，孙俊良，刘本国

（河南科技学院食品学院，河南 新乡 453003）

类黄酮是自然界中广泛存在的一大类酚类物质，具有抗氧化、抗炎、抗病毒、降血压、降血糖和抗肿瘤等生物活性，是茶及众多中草药的活性成分[1-3]。但类黄酮的低水溶性和促氧化问题限制了其活性发挥和实际应用[4-5]。天然类黄酮聚合物，如茶黄素、原花色素和单宁等，具有比类黄酮单体更高的水溶性和生物活性[6-8]。这表明聚合反应能改善类黄酮的水溶性、减弱其促氧化性。类黄酮的聚合在食品加工中也广泛存在，如葡萄酒中的儿茶素与乙醛的缩聚物对酒的风味和外观有重要影响[9-10]。类黄酮的聚合可采用化学法和酶法。Geng Sheng等[11]采用化学法合成了儿茶素与甲醛酸的聚合物，Kim等[12]在乙醇溶剂中通过缩合反应生成了一系列儿茶酚-醛寡聚物。与儿茶素单体相比，这些衍生物均显示出更高的清除超氧阴离子自由基能力和抑制人低密度脂蛋白氧化活性[13]。但化学聚合法存在区域选择性差、毒副性残留、原料损失大、产物收率低、环境不友好等诸多问题。漆酶是一种含铜的氧化还原酶，最早从紫胶漆树的分泌物中发现，可催化多酚、多胺、木质素的氧化[14-15]。由于漆酶在催化作用的过程中主要生成产物是水，因此被认为是一种绿色型酶制剂受到国内外研究者的关注[16]。

2013年显齿蛇葡萄叶被列入国家新食品原料。二氢杨梅素（图1）为一种二氢黄酮醇类物质，是显齿蛇葡萄叶的主要活性成分，含量可占干叶质量的20%以上，具有多种生物活性，已实现规模化生产[17-18]。但二氢杨梅素水溶性低、稳定性差的缺点限制了其在食品中的广泛应用，课题组的前期研究也表明二氢杨梅素的α-葡萄糖苷酶抑制活性远逊于显齿蛇葡萄叶中的单宁组分[19]。已有研究表明类黄酮聚合物对黄嘌呤氧化酶和酪氨酸酶的抑制能力优于相应单体[20]。受此启发，本研究拟以漆酶为催化剂，制备二氢杨梅素聚合物，系统考察反应时间、漆酶添加量、反应温度、pH值等因素对产物颜色、α-葡萄糖苷酶抑制及抗氧化活性的影响，并运用波谱手段表征该衍生物结构。

图1 二氢杨梅素的化学结构Fig. 1 Chemical structure of dihydromyricetin

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

二氢杨梅素、阿卡波糖、溴化钾（均为光谱级）上海阿拉丁生化科技股份有限公司；漆酶（来自漆树）、α-葡萄糖苷酶（来自酿酒酵母）、对硝基苯-α-D-吡喃葡糖苷（p-nitrophenyl-α-D-glucopyranoside，pNP-G）、1,1-二苯基苦基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl radical，DPPH）、2,2’-联氮双(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)二铵盐（2,2’-azinobis (3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid) diammonium salt，ABTS）美国Sigma-Aldrich公司；其他试剂均为分析纯。

1.2 仪器与设备

CR-400色差计 日本美能达公司；TU-1810PC紫外-可见分光光度计 北京普析通用仪器有限公司；TENSOR27傅里叶变换红外光谱仪、Avance 600 MHz核磁共振波谱仪 德国Bruker公司；7200型可见光分光光度计 尤尼柯（上海）仪器有限公司；GenPure UF/UV纯水超纯水系统 美国Thermo Scientific公司；ME104电子天平 梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司；SHA-C水浴恒温振荡器 金坛市中大仪器厂；Alphal-2LD plus真空冷冻干燥机 德国Christ公司。

1.3 方法

1.3.1 二氢杨梅素的酶促修饰

将二氢杨梅素和漆酶溶于0.1 mmol/L pH 3.8～7.8磷酸缓冲液，在一定水浴温度下（25～45 ℃），150 r/min振荡反应指定时间（6～48 h），体系中二氢杨梅素质量浓度固定在2 mg/mL，漆酶浓度为1～9 U/mL，反应完毕后，冷冻48 h，而后冷冻干燥，得二氢杨梅素酶促衍生物。

1.3.2 色度测定

使用色差计对样品进行色度分析，仪器用标准白板（L*=96.86，a*=－0.15，b*=1.87）校正后，测定二氢杨梅素酶促衍生物的色度，记录L*、a*和b*值，重复测定5 次，取平均值。

1.3.3α-葡萄糖苷酶抑制能力测定

pNP-G作为底物时可被α-葡萄糖苷酶水解为黄色且在波长405 nm处有最大吸收的对硝基苯酚，其可反映α-葡萄糖苷酶活性。参照文献[21]的方法，1 mL 0.2 U/mLα-葡萄糖苷酶溶液与0.5 mL不同浓度样品在试管中混合，对照管用0.5 mL磷酸盐缓冲液（0.1 mol/L，pH 6.8）代替样品，在37 ℃水浴中反应10 min，随后加入底物1.0 mL 1.0 mmol/L pNP-G溶液，反应20 min，最后迅速加入1 mL无水乙醇，终止反应，用超纯水定容至5.0 mL，测定405 nm波长处的吸光度。样品的α-葡萄糖苷酶抑制率效果用半抑制浓度（IC50）进行比较，抑制率计算如式（1）所示：

1.3.4 DPPH自由基清除力测定

参照文献[22]的方法，将2.0 mL不同浓度样品的乙醇溶液与2.0 mL 0.2 mmol/L DPPH-乙醇溶液在试管中充分混合，室温下避光反应30 min，测定反应液在517 nm波长处吸光度（A样品），用无水乙醇调零。各样品不同浓度各设置一个空白管扣除样品颜色对实验的影响，即2.0 mL对应浓度的样品溶液与2.0 mL乙醇溶液的混合，其吸光度为A空白。对照管为2.0 mL DPPH溶液与2.0 mL乙醇混合，其吸光度为A对照。DPPH自由基清除能力的计算如式（2）所示：

1.3.5 ABTS阳离子自由基清除力测定

参照文献[23]的方法，将100 mL 7 mmol/L ABTS溶液与1.75 mL 2.45 mmol/L过硫酸钾溶液均匀混合，避光反应12 h，得ABTS阳离子自由基母液。使用pH 7.4、0.05 mol/L的磷酸缓冲液对其进行稀释，至其在734 nm波长处吸光度为0.7左右，得ABTS测试液。分别取1 mL不同浓度的样品溶液，加入ABTS测试溶液2 mL，充分混匀，在室温下反应10 min，测定其在734 nm波长处吸光度，ABTS阳离子自由基清除能力的计算如式（3）所示：

1.3.6 紫外光谱测定

将样品溶于适量甲醇中，测定其在220～400 nm波长范围内的紫外吸收光谱。

1.3.7 红外光谱测定

将溴化钾在烘箱中烘干，先以溴化钾压片作为背景进行校准，分别取少量样品与溴化钾混合并充分研磨，用压片机10 MPa下压片，用红外光谱仪记录其400～4 000 cm－1范围内的红外光谱。

1.3.8 核磁测定

称取50 mg左右样品溶于1 mL DMSO-D6，转移到核磁管中，采用核磁共振波谱仪测定样品的1H和13C核磁谱。所有操作在25 ℃进行。

1.4 数据处理

2 结果与分析

2.1 色度分析

漆酶在氧气存在的情况下，可催化小分子芳香族化合物氧化生成活性自由基，从而引发其聚合生成高分子化合物。本研究利用漆酶的这一催化特性，将二氢杨梅素单体聚合生成有色聚合物，其可用作新型食用色素。25 ℃水中二氢杨梅素的溶解度约为0.28 mg/mL，而其有色聚合物在水中的溶解度可高达33.20 mg/mL，酶法修饰能显著提高二氢杨梅素水溶性。同时，反应时间、漆酶浓度、反应温度、pH值对产物颜色有显著影响（图2和表1）。当固定漆酶浓度5 U/mL、pH 5.8、反应温度35 ℃时，随着反应时间的延长（6～48 h），二氢杨梅素衍生物的亮度减少（L*值减小），产品均偏红黄色（a*值和b*值均大于0），颜色差异不大（ΔE值接近）；当pH 5.8、反应温度35 ℃、反应时间36 h时，随着漆酶浓度的增大（1～9 U/mL），衍生物的亮度、红黄值均降低，样品间的色差显著增大；当漆酶浓度5 U/mL、pH 5.8、反应时间36 h，可发现较之其他因素，反应温度（25～45 ℃）对样品色度的影响较小；当漆酶浓度5 U/mL、反应时间36 h、反应温度35 ℃时，pH值引起的样品色度变化显著高于其他因素。pH值为3.8和7.8时，酶促反应较难进行，样品的色度指标与二氢杨梅素接近；pH值为4.8和6.8时，酶促反应虽能进行，但亮度值下降不大，显著高于pH值为5.8时获得的样品，表明所用漆树漆酶的最适催化pH值在5.8左右，而前人研究也表明漆酶催化木质素的最适反应pH值为6[24]。

图2 反应时间（a）、漆酶浓度（b）、反应温度（c）、pH值（d）对二氢杨梅素衍生物颜色的影响Fig. 2 Effects of reaction time (a), laccase concentration (b), reaction temperature (c) and pH (d) on the color of dihydromyricetin derivatives

表1 二氢杨梅素衍生物的色度分析Table 1 Chroma analysis of dihydromyricetin derivatives

续表1

2.2 α-葡萄糖苷酶抑制活性

α-葡萄糖苷酶与糖尿病并发症的发生有关，糖尿病治疗药物常以该酶为作用靶标，但这些药物在应用中却存在毒副作用大的问题[25-26]。最新研究表明天然类黄酮聚合物，如茶黄素、原花色素和单宁等，具有比类黄酮单体更高的生物活性[27-28]，这提示可通过制备类黄酮聚合物的方式，提高类黄酮的α-葡萄糖苷酶抑制活性。本研究中，酶促反应条件不仅对二氢杨梅素衍生物颜色有显著影响，对其生物活性也可能有重要影响。系统考察了反应时间、漆酶浓度、反应温度、pH值对二氢杨梅素衍生物的α-葡萄糖苷酶抑制活性的影响。二氢杨梅素抑制α-葡萄糖苷酶的IC50值为85.95 μg/mL。如图3所示，当固定漆酶浓度5 U/mL、pH 5.8、反应温度35 ℃时，随着反应时间的延长，样品的IC50值逐渐降低，当反应时间为24 h，其基本保持恒定，反应时间的适当延长有利于产物酶抑制活性的提高。与之类似，漆酶浓度的适当增加亦可显著提高产物活性，但当漆酶浓度超过5 U/mL时，继续增加，产物的活性提高不明显。反应温度对产物活性的影响则呈现U型特征，在35 ℃条件下制得的衍生物抑制效果最佳（IC506.2 μg/mL）。当pH 3.8时，所得产物在200 μg/mL时的抑制率仅为4%，IC50因而未能测出，而pH 7.8时所得产物的IC50为45 μg/mL。这表明在上述pH值条件下，漆酶催化活性不高。而pH值为5.8和6.8时所得产物表现出较强的酶抑制活性，且二者IC50值接近。为了进一步考察漆酶修饰对二氢杨梅素活性和结构的影响，挑选在反应温度35 ℃、pH 5.8、反应时间36 h，漆酶浓度分别为1、3、5 U/mL时获得的二氢杨梅素衍生物（分别表示为U-1、U-3和U-5）为代表性样品用于后续的抗氧化和结构表征。

图3 反应时间（a）、漆酶浓度（b）、反应温度（c）、pH值（d）对二氢杨梅素衍生物的α-葡萄糖苷酶抑制效果的影响Fig. 3 Effects of reaction time (a), laccase concentration (b), reaction temperature (c) and pH (d) on α-glucosidase inhibitory activity of dihydromyricetin derivatives

2.3 DPPH自由基清除能力

由图4可知，二氢杨梅素及其衍生物（U-1、U-3、U-5）均表现出DPPH自由基清除能力，且呈量效关系，其IC50值依次为5.32、54.28、54.68、54.86 μg/mL，漆酶的氧化聚合导致了二氢杨梅素的抗氧化能力显著降低。

图4 二氢杨梅素及其衍生物的DPPH自由基清除能力Fig. 4 DPPH radical scavenging activity of dihydromyricetin and its derivatives

2.4 ABTS阳离子自由基清除能力

图5 二氢杨梅素及其衍生物的ABTS阳离子自由基清除能力Fig. 5 ABTS radical cation scavenging activity of dihydromyricetin and its derivatives

如图5所示，随着样品质量浓度的增大，其ABTS阳离子自由基清除能力呈线性上升，二氢杨梅素、U-1、U-3和U-5的IC50值分别为4.81、39.32、44.42、99.99 μg/mL。二氢杨梅素衍生物的活性均低于二氢杨梅素，并且其活性与制备时所用漆酶浓度呈反比关系。结合DPPH实验结果，推测漆酶通过氧化二氢杨梅素上酚羟基形成聚合物，导致了衍生物抗氧化活性的降低。

2.5 二氢杨梅素衍生物的紫外光谱分析

紫外光谱在类黄酮结构测定中占有非常重要的地位，其可确定类黄酮骨架和羟基的取代位置。典型的类黄酮化合物的紫外图谱上一般有2 个吸收带，240～285 nm（带II）和300～550 nm（带I）。一般认为带I主要与类黄酮B环上的肉桂酰生色基团有关，带II与A环上的苯甲酰生色基团有关。如图6所示，二氢杨梅素属于二氢黄酮醇类物质，只有苯甲酰系统，因此主要体现带II特征，带I仅呈肩峰，其最大吸收峰位于在289 nm处。而U-1、U-3和U-5的紫外图谱仍体现二氢杨梅素特征，证明二氢杨梅素骨架结构在衍生物中得到保留，但带I的相对强度提高，且最大吸收峰发生了蓝移，出现在了292 nm波长处，表明苯环上的酚羟基发生了取代。

图6 二氢杨梅素及其衍生物紫外图谱Fig. 6 Ultraviolet spectra of dihydromyricetin and its derivatives

2.6 红外光谱分析

图7 二氢杨梅素及其衍生物红外图谱Fig. 7 Infrared spectra of dihydromyricetin and its derivatives

波长在2～25 μm的中红外光谱专属性极强，能用来分析大多数化合物，反映化学反应过程中的基团变化情况。如图7所示，二氢杨梅素具有3 213（酚羟基）、1 391（苯环）、1 630（羰基）、1 169（C—H伸缩振动）、1 081 cm－1（C—O伸缩振动）等特征吸收峰。酶促氧化聚合物后，二氢杨梅素的红外图谱发生了显著变化：随着漆酶浓度的增加，所得衍生物的酚羟基特征吸收峰强度逐渐降低，而C—O伸缩振动峰强度逐渐提高。这表明漆酶通过催化酚羟基氧化，而后以醚键相连，实现二氢杨梅素的聚合。Sun Xuejiao等[29]发现以邻苯二酚为底物，采用漆酶催化其进行聚合反应，产物中邻苯二酚单体结构单元以醚键相连接，这与本实验结果一致。

2.7 核磁共振波谱分析

由于U-5衍生物的聚合度较大，其不能溶于测试溶剂，因此本研究仅对二氢杨梅素、U-1和U-3进行了核磁分析。二氢杨梅素的1H和13C核磁共振峰的归属解析如图8、9所示，其与文献报道一致[30]。U-1和U-3的核磁共振图谱其仍然体现了二氢杨梅素的结构特性，但除C-5上所连酚羟基，其他的酚羟基信号与完全消失，这与红外光谱结果相印证，表明这表明漆酶通过催化酚羟基氧化实现二氢杨梅素的聚合。

图8 二氢杨梅素及其衍生物的13C核磁共振图谱Fig. 8 13C-NMR spectra of dihydromyricetin and its derivatives

图9 二氢杨梅素及其衍生物的1H核磁共振图谱Fig. 9 1H-NMR spectra of dihydromyricetin and its derivatives

3 结 论

漆酶可用于二氢杨梅素的氧化聚合，反应时间、反应温度、酶浓度和pH值对二氢杨梅素衍生物的颜色有规律性影响。修饰后，二氢杨梅素抑制α-葡萄糖苷酶的能力得到显著提高，而DPPH自由基和ABTS阳离子自由基清除能力却下降。波谱分析表明漆酶通过催化酚羟基氧化，而后以醚键连接，实现二氢杨梅素聚合。所得二氢杨梅素衍生物具有一定抗氧化活性和突出的α-葡萄糖苷酶抑制活性，可用作食品色素，或作为降糖因子用于糖尿病人特膳食品。本研究对促进二氢杨梅素在食品中的应用，推动新型功能性食品开发具有重要意义。