超高效液相色谱-串联质谱法测定小麦籽粒中25种磺酰脲类除草剂残留

刘 炜， 刘 行， 杨晓凤， 尹 全， 张义蓉， 张富丽， 刘 茜

(1. 四川省农业科学院分析测试中心，四川 成都 610066; 2. 四川省农业科学院经济作物育种栽培研究所，四川 成都 610300)

0 引 言

磺酰脲类除草剂是全球主流除草剂之一，具有品种较多、高活性、低毒、低剂量、广谱、高选择性等特点，对农牧业的增产起到了十分重要的作用[1-2]。磺酰脲类除草剂由芳香基、磺酰脲桥和杂环三部分组成，属于内吸传导型选择性除草剂，通过对植物体内的乙酰乳酸合成酶(ALS)的抑制，从而阻碍支链氨基酸(缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸)生物合成，导致底物α-丁酮的积累，抑制植物细胞的分裂和生长，使细胞不能正常生长[3]。

小麦是中国主要的粮食作物之一，也是中国重要的商品粮和战略储备粮，对提升我国农民的经济收入，保证农村地区的稳定、保障国家粮食安全方面具有重要意义[4-6]。2019年中国小麦种植面积为23 727千公顷，占我国粮食作物总面积的20%左右，小麦产量为13 359万吨，占我国粮食总产量的20%左右[7]。在小麦种植过程中影响高产稳产、品质的因素很多，麦田农田杂草（雀麦、野燕麦、节节麦等禾本科杂草以及播娘蒿）是影响产量、品质的重要因素之一，目前化学除草是保障小麦高产稳产、品质的重要措施[8]。该类除草剂广泛应用于小麦中害虫综合治理，但不合理的使用导致小麦中农药残留，对消费者健康和环境造成长期的风险。目前，我国磺酰脲类农药残留限量还不够完善，GB 2763—2019《食品中农药最大残留限量标准》只对部分磺酰脲类除草剂在小麦的最大残留限量值规定，在0.01～0.1 mg/kg之间[9]，为了规避潜在健康风险，建立一种同时检测小麦籽粒中25种磺酰脲类除草剂的方法是必要的。

近几年，磺酰脲类除草剂的残留分析方法主要有色谱法[10-11]，色谱-串联质谱法[12-15]，毛细管电泳法[16]。目前已有关于小麦中磺酰脲类除草剂残留检测的报道，但关于同时检测小麦籽粒中25 种磺酰脲类除草剂的方法尚未见报道，本文以 QuEChERS前处理技术为基础，建立了同时测定小麦籽粒中25种磺酰脲类除草剂的超高效液相色谱-串联质谱法 (UPLC-MS/MS)，旨在为小麦中农药残留检测提供高效技术支持。

1 材料与方法

1.1 药剂、试剂与仪器

25种磺酰脲类除草剂标准品，纯度均大于97%（德国Dr. Ehrenstorfer公司）；甲醇、乙腈（质谱纯/色谱纯，美国 Fisher 公司）；甲酸、甲酸铵（色谱纯，上海安谱实验科技股份有限公司）；氯化钠（分析纯，四川西陇化工有限公司）；无水硫酸镁（德国CNW 科技公司）；石墨化炭黑(GCB)、十八烷基键合相硅胶（C18）、乙二胺-N-丙基硅烷（PSA）（上海安谱实验科技股份有限公司）；试验用水均为超纯水。

Waters I CLASS XEVO TQ XS超高效液相色谱-串联质谱仪(配ESI离子源)（美国沃特世公司）；高速万能粉碎机（北京市永光明医疗仪器有限公司）；JA3003分析天平（上海精密科学仪器有限公司）；涡旋振荡器（美国Scientific Industries公司）；Neofuge 18R高速离心机（香港力康生物医疗科技控股集团）；超纯水仪（Milli-Q 型超纯水仪）；0.22 μm有机系滤膜（美国安捷伦公司）。

1.2 标准溶液的配制

分别准确称取25种农药标准品各10.00 mg于10 mL容量瓶中，用乙腈溶解并定容至刻度，配制成质量浓度为1 000 mg/L的标准储备液。临用时，根据实验需要，用乙腈或小麦籽粒空白基质溶液稀释混合标准溶液，配成不同质量浓度的标准工作溶液。

1.3 基质效应

基质效应( Matrix effect，ME) 是指样品中目标分析物以外的组分，对目标分析物的分析过程有显著的干扰，从而影响目标分析物定量分析的准确度和重现性的现象[17]。小麦籽粒基体比较复杂，含有大量的色素、淀粉等共提取物，在前处理过程中，小麦籽粒样品中的共提取物与目标化合物一同进入质谱系统，会对目标化合物的离子化程度产生一定影响，造成响应信号的抑制或提高[18]。在农药残留定量分析中，为了有效地减少干扰物，消除基质效应，选择合适的样品前处理方法、色谱分离条件、质谱条件、使用内标、基质匹配标准溶液等有效手段，其中优化前处理方法，采用基质匹配标准溶液是最常用的手段[19]。采用基质校准曲线的斜率与纯溶剂标准曲线的斜率比值来评价基质效应。当0.8＜ME＜1.2 时为弱基质效应，可以接受；当ME＜0.8是为基质抑制效应；当ME＞1.2是为基质增强效应[20]。

1.4 仪器条件

色谱条件：Waters ACQUITY UPLC CSH C18 Column（100 mm×2.1 mm, 1.7 μm）；柱温：40 ℃；进样体积：1.0 μL；流量：0.3 mL/ min。流动相 A：10 mmol/L甲酸铵水溶液（含0.1%甲酸），流动相B：甲醇；流动相梯度洗脱程序见表1

表1 流动相梯度洗脱程序

质谱条件：采用正离子扫描，电喷雾离子源(ESI)；毛细管电压：3.0 kV；锥孔反吹气为氮气，流量：150 L/h；碰撞气为氩气，压力为 230 kPa；脱溶剂气体流量：800 L/h；脱溶剂温度：500 ℃；离子源温度：150 ℃。多反应监测模式 (MRM)，具体质谱参数见表2，0.01 mg/L混合标准溶液的MRM色谱图见图1。

表2 25种除草剂的质谱检测条件1）

图1 MRM 模式下 25 种除草剂混合标准溶液的总离子流色谱图

1.5 样品前处理

称取已粉碎的小麦籽粒样品5.0 g(精确至0.1 g)于50 mL离心管中，加入5.0 mL 水和 20.0 mL含1%甲酸的乙腈，涡旋 5 min；加入3.0 g 氯化钠，涡旋 2 min，8 000 r/min离心5 min；取上清液2.0 mL于含有 80 mg C18，200 mg无水 MgSO4的 10 mL离心管中，涡旋 2 min，8 000 r/min 离心 5 min， 取上清液过滤膜供UPLC-MS/MS分析。

2 结果与分析

2.1 色谱及质谱条件的选择

在ESI正离子和负离子模式下，对甲醇配制的1.0 mg/L的 25种磺酰脲类除草剂单标准溶液进行进入一级质谱后，25种除草剂在正离子模式下均可得到稳定的、灵敏度高的母离子。对25种磺酰脲类除草剂进行二级质谱分析，优化子离子、锥孔电压以及碰撞能量等质谱条件，最终获得25种磺酰脲类除草剂的最佳多反应监测模式( MRM) 的质谱参数(见表2)。

分别比较了不同类型的色谱柱（Waters ACQUITY UPLC BEH C18 Column（100 mm×2.1 mm, 1.7 μm）、Waters ACQUITY UPLC CSH C18 Column（100 mm×2.1 mm, 1.7 μm）、Waters ACQUITY UPLC HSS T3 Column （100 mm×2.1 mm, 1.8 μm）对目标化合物的分离效果，发现CSH C18色谱柱的分离效果、峰型、响应值最佳。

采用梯度洗脱，比较了甲醇、乙腈分别与水组成的流动相系统对25种目标化合物的洗脱效果，经过比较分离效果、峰形对称性及灵敏度，确定甲醇-水作为流动相。由于磺酰脲类除草剂有弱酸性，在流动相中加入0.1%甲酸和10 mmol/L甲酸铵后，吡嘧磺隆与环丙嘧磺隆，啶嘧磺隆与苄嘧磺隆，甲嘧磺隆与甲磺隆之间的分离效果更好，其他除草剂的响应值得到提高，且改善了色谱峰峰形。因此，选择以含0.1%甲酸的10 mmol/L甲酸铵水溶液-甲醇作为流动相。

2.2 前处理方法的选择

考虑到小麦籽粒样品中含水量低这一特点，为了改善提取和净化效果，预先向已粉碎的小麦籽粒样品中加入适量的水，以利于极性的磺酰脲类除草剂的提取，从而提高农药的回收率，比较加水量3.0 mL、5.0 mL、10.0 mL对回收率的影响，结果表明，加水量为5.0 mL最合适。

比较了甲醇、乙腈、含1%甲酸的乙腈对25种的提取效率（图2）。结果表明，以甲醇为提取剂时，苯磺隆、醚苯磺隆、烟嘧磺隆、甲酰胺磺隆的回收率仅为45.5%、56.8%、65.3%、66.1%。以乙腈为提取溶剂时，25种磺酰脲除草剂的回收率为86.8%～100.7%；以含1%甲酸的乙腈为提取溶剂时，25种磺酰脲除草剂的回收率为88.5%～112.9%，乙腈中加入1%甲酸，可提高对碱性敏感农药( 如单嘧磺隆)的回收率。因此，最终选择含1%甲酸的乙腈作为提取试剂。

图2 25种除草剂在不同提取溶剂中的平均回收率

2.3 净化条件的优化

小麦籽粒基质较为复杂，含有较多的淀粉和油脂，提取目标化合物的同时，也提取出大量的油脂色素等杂质。GCB、PSA及C18是QuEChERS方法中常用的净化剂，用于可以去小麦籽中色素、凿醇、脂类、糖类等杂质。比较了GCB、PSA及C18的净化效果。结果表明， GCB作为净化剂时，净化效果较好，但对25种磺酰脲除草剂产生吸附，降低了回收率，回收率在18.2%～74.1%之间；PSA作为净化剂时，净化效果较好，回收率在75.2%～85.1%之间。不同质量（40 mg、60 mg、80 mg、100 mg）C18作为净化剂时，加入80 mg C18 净化效果好， 25种磺酰脲除草剂的回收率在88.9%～105.2%之间。

2.4 方法的线性关系、检出限、定量限及基质效应

用小麦籽粒空白基质溶液配制系列基质匹配标准工作溶液，以目标化合物的峰面积(y)与对应的质量浓度 (x)绘制标准曲线。分别以3倍信噪比和10倍信噪比计算方法的检出限( LOD) 和定量下限( LOQ)。目标物的线性相关系数（r2）在0.996 2～0.999 4 之间，检出限在 0.006 ～0.21 μg/kg 之间，定量限在0.019 ～0.71 μg/kg之间，能够满足小麦籽粒中磺酰脲除草剂定量分析的基本要求。ME在0.83～1.13之间，基质效应不明显，可以忽略，具体结果见表3。

表3 25种除草剂的线性关系、检出限、定量限及基质效应

2.5 方法的准确度和精密度

选取小麦籽粒空白样品，依据小麦籽中25种磺酰脲除草剂的 MRL 值以及方法的灵敏度添加3个浓度进行添加回收试验，每个添加水平重复7次，按上述所述前处理方法及条件进行测定，计算25种磺酰脲类除草剂的平均添加回收率及相对标准偏差（RSD）。25种磺酰脲类除草剂的平均添加回收率均在85.9%～107.2%之间，相对标准偏差（RSDs）0.9%～6.8 % 之间，该分析方法准确性和精密度满足小麦籽粒中25种磺酰脲类除草剂残留分析的要求，具体结果见表4。

表4 25种磺酰脲类除草剂在小麦籽粒中的平均添加回收率和相对标准偏差(n =7)

2.6 实际样品测定

采用本研究建立的方法对市场采购的20份小麦籽粒样品进行检测。结果表明：2种除草剂分别有样品检出。其中：苄嘧磺隆2份，含量为0.042 4 mg/kg和0.035 6 mg/kg，超出GB 2763—2019规定的最大残留限量值0.02 mg/kg；胺苯磺隆1份，含量为0.023 5 mg/kg，GB 2763—2019未规定限量值。其他样品均无除草剂检出，此方法适用小麦籽粒中磺酰脲类除草剂多残留的筛查。

3 结束语

本文以 QuEChERS 前处理技术为基础，建立了同时测定小麦籽粒中25种磺酰脲类除草剂的超高效液相色谱-串联质谱法 (UPLC-MS/MS)。在1～100 μg/kg添加水平下，平均回收率在 85.9%～107.2%之间，相对标准偏差（RSDs）为0.9%～6.8%之间，检出限在 0.006～0.21 μg/kg之间，定量限在0.019 ～0.71 μg/kg 之间，该方法前处理简单，分析时间短，准确度和灵敏度高，基质效应不明显，适合小麦籽粒样品中磺酰脲类除草剂的实际检测需要。