miR-205-5p对RBM47的调控作用及对食管鳞癌细胞侵袭迁移的影响*

张怀忠, 吴旭辉, 吴功志, 朱双媚

丽水市人民医院 1胸心外科， 2肿瘤放疗科(浙江丽水 323000)

食管癌是世界上第八大癌症，其病死率位于世界恶性肿瘤的第6位，是消化道系统及胃肠道最常见、最具侵袭性的肿瘤之一[1-2]。食管鳞癌(esophageal squamous cell carcinoma，Escc)是我国食管癌的主要病理类型，患者发病率及病死率较高[3-4]。随着我国医疗技术的发展，手术及放疗等多学科治疗虽能在一定程度上改善患者生存，但患者预后及5年生存率仍不理想[5]。故寻找有效的分子标志物及探究Escc高侵袭迁移的分子机制，对改善Escc患者预后有潜在的临床意义。研究证实微小RNA(MicroRNA，miRNA)与肿瘤迁移、侵袭关系密切[6]，miRNA家族的miR-205已被证实可增强DNA修复，抑制细胞凋亡并促进Escc细胞集落存活[7-8]。miR-205的亚型miR-205-5p也被发现参与皮肤鳞癌、胃癌、宫颈癌等多种肿瘤的侵袭、迁移生物学过程[9-10]。但miR-205-5p在Escc侵袭、迁移过程中的调控机制研究较少。另外，近来研究发现RNA结合蛋白47(RBM47)丢失是导致结直肠癌、乳腺癌及非小细胞肺癌转移的重要因子之一[11-12]。但RBM47是否也参与Escc侵袭、迁移过程还未见报道。本研究2019年3月至2021年1月用基因预测网站发现miR-205-5p与RBM47之间存在靶向关系，并通过培养Escc细胞，探究miR-205-5p与RBM47在肿瘤侵袭迁移过程的调控机制，以期为Escc的靶向治疗提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料 人食管上皮细胞(HET-1A)及人食管鳞状细胞癌细胞系(TE14和KYSE70)(上海细胞研究所，MZ0641、MZ-2281、MZ1694)；RPMI-1640培养基(上海经科化学科技有限公司，GNM-31800)；10%胎牛血清(上海联硕生物科技有限公司，A3160801)；链霉素-青霉素混合液(北京百奥莱博科技有限公司，SJ0704)；CCK-8试剂盒(上海吉至生化科技有限公司，CA1210-5000T)；RNA提取试剂盒(北京天漠科技开发有限公司，TR205-50)；逆转录试剂盒(上海科敏生物科技有限公司，205111)；Matrigel基质胶(上海钰博生物科技有限公司，YB356234)；RBM47、侵袭迁移相关蛋白E-钙粘蛋白(E-cadherin)及锌指E-盒结合同源异形盒1(ZEB1)等抗体(美国abcam公司，ab154176、ab40772、ab203829)；ECL显色试剂盒(上海古朵生物科技有限公司，GD-Y2042)；BCA蛋白定量试剂盒(上海恒斐生物科技有限公司，AR0146)；qRT-PCR仪(上海力康科技有限公司，T960)；酶标仪(奥地利Tecan公司，Tecan Infinite F50)。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养 取HET-1A及Escc细胞系(TE14和KYSE70)常规复苏后，用RPMI-1640培养基(含10%胎牛血清和100 U/mL青霉素-链霉素)，在37℃、5% CO2恒温培养箱中培养，并用0.25%胰蛋白酶进行消化传代。

1.2.2 qRT-PCR检测不同细胞系中miR-205-5p、RBM47 mRNA相对表达水平 用RNA提取试剂盒分别提取Escc细胞系(TE14和KYSE70)和HET-1A细胞系中总RNA，用逆转录试剂盒得到cDNA，以cDNA为模板，按照qRT-PCR试剂盒说明书进行PCR反应(反应体系：上下游引物各0.5 μL，H2O 8 μL，2×SYBR mix 10 μL，10×cDNA模板1 μL。反应条件：95℃预变性10 min、95℃变性20 s、60℃退火55 s、50个循环、72℃延伸15 min)。miR-205-5p以U6为内参，RBM47以GAPDH为内参，用2-ΔΔCt算法，计算miR-205-5p、RBM47 mRNA表达水平。各引物序列由大连宝生物公司合成，见表1。

表1 引物序列表

1.2.3 细胞转染及分组处理 取KYSE70细胞系，用胰蛋白酶消化后，按照5×104个/孔的密度将细胞接种于96孔板内，并设置为空白对照组、miR-205-5p抑制剂(miR-205-5p-inhibitor)组、miR-205-5p抑制剂阴性对照(miR-205-5p-NC)组、RBM47过表达腺病毒(Ad-RBM47)组、Ad-RBM47阴性对照(Ad-eGFP)组，每组设置6个复孔。空白对照组不作任何处理正常培养，其余各组待细胞融合度达50%～60%时，用转染试剂盒向KYSE70细胞转染miR-205-5p-inhibitor及miR-205-5p-NC试剂，得到miR-205-5p-inhibitor组及miR-205-5p-NC组；采用腺病毒向KYSE70细胞转染RBM47过表达序列及空载体，得到Ad-RBM47组及Ad-eGFP组。各转染组于转染后24 h，取细胞进行后续试验。

1.2.4 RT-qPCR检测各组细胞miR-205-5p、RBM47 mRNA的相对表达水平 取转染24 h后的各组细胞，用RNA提取试剂盒提取总RNA，按1.2.2项下的检测方法，检测各组细胞miR-205-5p、RBM47 mRNA表达水平。

1.2.5 CCK-8法检测细胞增殖活性 取转染后24 h的各组细胞，加入10 μL CCK-8溶液继续培养2 h后，在酶标仪上于450 nm波长下检测各组细胞的OD值，以空白对照组为对照，根据公式细胞存活率=(试验组OD值/空白组OD值)×100%计算细胞存活率，以存活率代表细胞增殖活性。

1.2.6 Transwell小室法检测细胞迁移侵袭能力 将转染后24 h的各组细胞，重悬为浓度为1×108个/mL的细胞悬液。取Transwell小室，向小室上室加入含10%胎牛血清的培养液100 μL，于小室下室加入含10 %胎牛血清的培养液室温孵育24 h后，取出小室，用4%多聚甲醛固定和结晶紫染色后，于光学显微镜下，随机取5个视野进行计数，以细胞数目多少代表细胞迁移能力。在Transwell小室上室铺比例为(Matrigel胶∶培养基=1∶8)的普通Matrigel胶工作液50 μL，室温孵育过夜过夜并待Matrigel胶凝固后，其余步骤同迁移试验，作为细胞侵袭能力检测。实验重复6次。

1.2.7 Western blot检测各组细胞RBM47、E-cadherin、ZEB1蛋白相对表达水平 取转染24 h后的各组细胞，用蛋白提取试剂盒及BCA定量试剂盒提取并测定细胞蛋白浓度后，取50 μg蛋白样品行电泳及半干法转膜反应，加入一抗(RBM47、E-cadherin、ZEB1抗体，稀释倍数均为1∶1 500，内参抗体GAPDH稀释倍数为1∶2 000)，于4℃孵育过夜后，加入辣根过氧化物酶二抗(稀释倍数1∶5 000)于室温下孵育3 h。显影曝光后，用化学发光成像分析系统拍照并分析灰度值。每组试验重复3次。

1.2.8 双荧光素酶验证miR-205-5p与RBM47的靶向关系 合成RBM47的3′非翻译区(3′UTR)的miR-205-5p识别序列，克隆至pmiRGlo载体，得到pmiRGlo-RBM47-3′UTR-WT。另外对miR-205-5p识别区RBM47碱基进行突变连接至pmiRGlo载体，得到pmiRGlo-RBM47-3′UTR-MUT，分别将pmiRGlo-RBM47-3′UTR-WT、pmiRGlo-RBM47-3′UTR-MUT质粒与miR-205-5p NC、miR-205-5p mimics共转染，得到miR-205-5p mimics+RBM47-3′UTR-MUT组、miR-205-5p NC+RBM47-3′UTR-MUT组、miR-205-5p mimics+RBM47-3′UTR-WT组、miR-205-5p NC+RBM47-3′UTR-WT组，各组均于24 h后添加萤火虫和海参荧光素酶试剂(按照双荧光素酶报告基因检测试剂盒说明书)上机检测。每孔的数值以萤火虫荧光活性/海参荧光活性显示，试验重复3次。

1.2.9 miR-205-5p-inhibitor与si-RBM47共转染后对细胞侵袭迁移能力的影响 取KYSE70细胞按照1×105个/孔的密度接种于96 孔板内，并设置为：miR-205-5p-inhibitor+si-RBM47组、miR-205-5p-inhibitor+si-RNA-NC组、miR-205-5p-NC+si-RBM47组、miR-205-5p-NC+si-RNA-NC组、未转染组(空白对照组)，miR-205-5p-inhibitor+si-RBM47组转染miR-205-5p抑制剂及RBM47干扰载体(si-RBM47)；miR-205-5p-inhibitor+si-RNA-NC组转染miR-205-5p-inhibitor及RBM47空载体(si-RNA-NC)，miR-205-5p-NC+si-RBM47组转染miR-205-5p-NC及si-RBM47；miR-205-5p-NC+si-RNA-NC组转染miR-205-5p-NC及si-RNA-NC，空白对照组不作任何处理，各组均于转染后24 h，取细胞按1.2.6方法检测细胞侵袭迁移能力。

2 结果

2.1 不同细胞系中miR-205-5p、RBM47 mRNA表达的影响 与正常食管上皮细胞(HET-1A)相比，ESCC细胞系(TE14和KYSE70)中miR-205-5p表达升高(P<0.05)，RBM47 mRNA表达降低(P<0.05)，其中在KYSE70细胞系中，miR-205-5p表达最高，RBM47 mRNA表达最低。见表2。

表2 不同细胞系中miR-205-5p、RBM47 mRNA表达比较

2.2 抑制miR-205-5p或激活RBM47表达对细胞miR-205-5p及RBM47 mRNA表达的影响 与空白对照组比较，miR-205-5p-inhibitor组细胞miR-205-5p表达降低(P<0.05)，RBM47表达升高(P<0.05)；Ad-RBM47组细胞RBM47 mRNA表达升高(P<0.05)，miR-205-5p表达差异无统计学意义(P>0.05)。miR-205-5p-NC组及Ad-eGFP组上述指标与空白组对照组相比，差异无统计学意义(P>0.05)。见表3。

表3 各组细胞miR-205-5p及RBM47 mRNA表达比较

2.3 抑制miR-205-5p或激活RBM47表达后对细胞增殖活性的影响 与空白对照组比较，miR-205-5p-inhibitor组及Ad-RBM47组细胞增殖活性降低(P<0.05)。miR-205-5p-NC组及Ad-eGFP组上述指标与空白对照组相比，差异无统计学意义(P>0.05)。见表4。

表4 抑制miR-205-5p或激活RBM47表达后各组细胞增殖活性比较

2.4 抑制miR-205-5p或激活RBM47表达对细胞侵袭迁移能力的影响 与空白对照组比较，miR-205-5p-inhibitor组及Ad-RBM47组细胞侵袭迁移能力降低(P<0.05)。miR-205-5p-NC组及Ad-eGFP组上述指标与空白对照组相比，差异无统计学意义(P>0.05)。见图1、表5。

图1 各组细胞侵袭迁移Transwell图(×200)

表5 各组细胞侵袭迁移能力比较 个

2.5 抑制miR-205-5p或激活RBM47表达对细胞RBM47、E-cadherin、ZEB1蛋白表达的影响 与空白对照组比较，miR-205-5p-inhibitor组及Ad-RBM47组细胞ZEB1蛋白表达降低(P<0.05)，E-cadherin、RBM47表达升高(P<0.05)。miR-205-5p-NC组及Ad-eGFP组上述指标与空白对照组相比，差异无统计学意义(P>0.05)。见图2、表6。

注：A：空白对照组；B：miR-205-5p-NC组；C：Ad-eGFP组；D：miR-205-5p-inhibitor组；E：Ad-RBM47组

表6 各组细胞中RBM47、E-cadherin、ZEB1蛋白表达水平比较

2.6 双荧光素酶试验验证miR-205-5p与RBM47靶向关系 miRtarbase预测显示，miR-205-5p与RBM47有结合位点。与miR-205-5p-NC+RBM47-3′UTR-WT组比较，miR-205-5p-mimics+RBM47-3′UTR-WT组荧光素酶活性降低(P<0.05)，miR-205-5p-NC+RBM47-3′UTR-MUT组、miR-205-5p-mimics+RBM47-3′UTR-MUT组荧光素酶活性比较差异无统计学意义(P>0.05)。见图3～4。

图3miRtarbase预测miR-205-5p与RBM47靶向关系

注：A：miR-205-5p-NC+RBM47-3′UTR-WT；B：miR-205-5p NC+RBM47-3′UTR-MUT组；C：miR-205-5p mimics+RBM47-3′UTR-WT组；D：miR-205-5p mimics+RBM47-3′UTR-MUT组；*与miR-205-5p-NC+RBM47-3′UTR-WT比较P<0.05

2.7 miR-205-5p-inhibitor与si-RBM47共转染后对细胞侵袭迁移能力影响 与空白对照组比较miR-125b-NC+si-RBM47组细胞侵袭迁移能力升高(P<0.05)；miR-205-5p-inhibitor+si-RNA-NC组细胞侵袭迁移能力降低(P<0.05)。与miR-205-5p-inhibitor+si-RNA-NC组相比，miR-205-5p-inhibitor+si-RBM47组细胞侵袭迁移能力升高(P<0.05)。miR-125b-NC+si-RNA-NC组与空白对照组相比，上述指标差异无统计学意义(P>0.05)。见图5、表7。

图5 各组细胞侵袭迁移Transwell图(×200)

表7 各组细胞侵袭迁移能力比较 个

3 讨论

据世界流行病学分析，预计到2040年世界食管癌患病率及病死率将是2018年患病人数的1.6倍左右[12]。食管癌中的亚型-Escc因其较高的发病率及转移率，而受到临床研究的重视[13]。MicroRNA(miR)与肿瘤增殖、凋亡及侵袭、迁移等生物学过程关系密切，且是最有前途的癌症诊断生物标志物之一[14]。余长云等[15]及Liu等[16]发现沉默miR-205-5p可抑制头颈鳞状细胞癌及结直肠癌的增殖、侵袭、迁移过程，提示miR-205-5p可作为促癌基因发挥生物学过程。杨屹立等[17]及Yamada等[18]发现miR-205-5p过表达可抑制胃癌及前列腺癌的增长及迁移过程，提示miR-205-5p可作为抑癌基因参与肿瘤生物学过程。而miR-205-5p在Escc发生发展过程中的调控作用研究较少。Ibuki等[6]发现miR-205-5p在Escc患者血清中表达水平高于食管腺癌患者，提示miR-205-5p过表达可能是导致Escc侵袭与转移的危险因素之一。本研究发现，miR-205-5p在Escc细胞系(TE14和KYSE70)中表达均异常高于人正常食管上皮细胞系(HET-1A)，且抑制KYSE70细胞中miR-205-5p表达后，KYSE70细胞增殖、侵袭、迁移能力显著低于空白对照组，提示miR-205-5p在Escc细胞中发挥促癌作用，沉默其表达可抑制Escc恶性生物学过程。研究证实E-cadherin为抑癌因子，ZEB1为致癌因子，且两者与肿瘤侵袭迁移关系密切[19]。范晓娜等[20]发现双皮质素样激酶1基因敲除可通过抑制ZEB1表达，上调E-cadherin表达，影响Escc细胞上皮间质转化来抑制Escc细胞侵袭迁移进程，提示E-cadherin、ZEB1与Escc侵袭迁移过程有关。本研究也在miR-205-5p抑制剂组检测到miR-205-5p表达降低后，与Escc侵袭迁移相关蛋白E-cadherin上调，ZEB1蛋白表达降低，进一步证实，抑制miR-205-5p表达，可抑制Escc侵袭迁移进程。但miR-205-5p促进Escc恶性生物学进程的分子机制还需继续探究。

RNA结合蛋白(RBP)在肿瘤上皮间质转化及侵袭迁移过程也发挥重要作用[21]。研究证实RNA结合蛋白RBM47可调控mRNA剪接、碱基编辑及多聚腺苷化过程，并在肿瘤发展过程中发挥显著作用[11]。Blanc等[22]发现RBM47基因敲除可抑制小鼠肠道RNA基因编辑，并推测RBM47降低可能是结直肠癌发生发展的危险因子。Vanharanta等[23]发现RBM47能改变靶mRNA子集的剪接和翻译，可通过使其靶RNA失活抑制乳腺癌的重新启动和生长，并推测RBM47的丢失是导致乳腺癌侵袭迁移的重要原因之一。本研究也发现，RBM47在Escc细胞系(TE14和KYSE70)中表达均异常低于人正常食管上皮细胞系(HET-1A)，且上调RBM47在KYSE70中表达后，随着RBM47 mRNA及蛋白表达的升高，与Escc侵袭迁移相关蛋白E-cadherin上调，ZEB1蛋白表达降低，Escc细胞表现出较低的侵袭迁移能力，提示RBM47可抑制Escc细胞侵袭迁移进程。本研究还发现，抑制miR-205-5p表达后，RBM47 mRNA及蛋白也呈升高趋势，进一步分析发现miR-205-5p与RBM47存在靶向负调控作用。为明确二者关系，本研究采用miR-205-5p-inhibitor与si-RBM47共转染，结果显示，miR-205-5p-inhibitor+si-RBM47组细胞侵袭迁移能力显著高于miR-205-5p-inhibitor+si-RNA-NC组，提示RBM47低表达可逆转miR-205-5p-inhibitor对Escc侵袭迁移能力的抑制作用。

综上所述，Escc细胞中miR-205-5p表达升高，RBM47表达降低，下调miR-205-5p表达可抑制Escc细胞侵袭迁移能力，其抑制作用可能与上调RBM47表达有关，这为阐明Escc发生发展的靶向调控机制提供一定理论依据，但本研究还存在一定的不足，miR-205-5p的调控机制复杂，miR-205-5p与Escc的其他靶向调控机制有待进一步探究。

利益相关声明：所有作者均声明不存在任何利益冲突。

作者贡献说明：张怀忠提出研究思路、设计研究方案、实施研究过程、论文撰写；吴旭辉、吴功志资料收集整理，进行统计学分析，指导论文修改。