高级别浆液性卵巢癌中细胞角蛋白19的表达和意义*

祝彩霞, 袁林静, 杨娟, 牛刚

中山大学附属第一医院妇产科(广东广州 510080)

上皮性卵巢癌是女性生殖道三大恶性肿瘤之一，发病率仅次于宫颈癌，病死率居首位。高级别浆液性卵巢癌(HGSOC)是主要的上皮性卵巢癌类型，占上皮性卵巢癌死亡的70%～80%[1]，进展型HGSOC指病理确诊HGSOC，临床分期FIGOⅢ期或FIGO Ⅳ期的卵巢癌。由于临床表现不典型和缺乏特异性的检测手段，患者确诊时多为进展型HGSOC，治疗以手术治疗和化疗为主，但术后中位无进展生存期仅为18个月[2]。细胞角蛋白19(cytokeratin19，CK19)是分子量最小的Ⅰ类细胞角蛋白，在非小细胞肺癌[3]、甲状腺癌[4]、宫颈癌[5]和肝细胞癌[6]中均有表达。研究认为，CK19可能通过一系列信号通路参与肿瘤的发生、发展[7]。目前关于CK19在进展型HGSOC的报道匮乏，因此探索进展型HGSOC中CK19的表达和调控机制有助于指导个体化治疗。本研究首先检测进展型HGSOC中CK19 mRNA的表达，体外实验分别验证CK19过表达对卵巢癌细胞的增殖和侵袭的影响，为进展型HGSOC的精准治疗提供新的方向。

1 资料与方法

1.1 一般资料 2004年1月1日至2014年12月31日我院术后病理确诊HGSOC患者128例，患者年龄33～88岁，平均(61.9±11.67)岁，临床分期均为FIGOⅢ/Ⅳ期(进展型)，所有患者均未行新辅助化疗，术后均应用TC方案化疗(铂类+紫杉醇)。选取患者肿瘤新鲜组织，保存用于后续实验。

纳入标准：(1)术前未进行放射、靶向、免疫和化学治疗；(2)病理确诊HGSOC；(3)临床病理分期为FIGO Ⅲ期或FIGO Ⅳ期；(4)患者临床资料完整，依从性高，配合随访。

排除标准：(1)术前行新辅助化疗、放射、靶向或免疫治疗；(2)临床病理分期为FIGO Ⅰ期或FIGO Ⅱ期；(3)合并其他类型肿瘤；(4)心、肝、肾等器官严重损伤；(5)卵巢癌复发者。

随访至患者死亡或截止至2019年12月，时间为2～240个月。总生存期(overall survival，OS)为初次治疗开始至死亡日或终检值；5年无进展生存期(progression-free survival，PFS)为初次治疗至疾病出现进展或任何原因死亡的时间。

研究经本院临床科研和实验动物伦理委员会审核批准(伦审[2017]222号)。

1.2 细胞及试剂 卵巢腺癌细胞株OVMZ-6由本单位实验室保存。细胞培养相关试剂：DMEM培养基、胎牛血清、Lipofectin(Life Technologies，美国)、逆转录试剂盒 (Invitrogen，美国)、CK19-pRc/RSV(吉玛，中国)；MTT(Sigma，美国)、Transwell小室(8 μm，Millipore，美国)；相关抗体：CK19和GAPDH(Abcam，美国)。

1.3 细胞培养和转染 应用Lipofectin试剂盒转染过表达CK19的质粒(CK19-pRc/RSV)和空载质粒(pRc/RSV)至生长对数期的卵巢腺癌细胞OVMZ-6，通过嘌呤霉素(G418)筛选获得CK19稳定过表达的OVMZ-6细胞(OV-CK19)和对照组OVMZ-6细胞(OV-VC)。

1.4 RT-PCR 提取上述HGSOC的肿瘤组织、OV-CK19细胞和OV-VC细胞的总RNA，逆转录合成cDNA，应用Taqman PCR反应体系对各样本的CK19 mRNA和内参HPRT进行qPCR反应，反应条件是：95℃ 3 min 预变性，95℃ 15 s，60℃ 1 min 延伸，共40个循环。CK19和内参HPRT应用Hs00761767_s1和Hs02800695_m1。相对表达量采用2-ΔΔCt法分析。

1.5 Western blot实验 提取OV-CK19和OV-VC细胞的蛋白，电泳后转移至PVDF膜，PDVF膜封闭后，加入一抗(CK19抗体)4℃孵育过夜，加入二抗室温孵育1 h。清洗后加入ECL溶液，应用激光成像系统显影检测CK19蛋白的表达。

1.6 MTT实验 分别将OV-CK19和OV-VC细胞接种到96孔板(2 000个/孔)，继续培养，分别在0、24、48、72 h后加入MTT，37℃孵育3 h后加入DMSO，室温孵育20 min，应用用酶联免疫检测仪读取每孔吸光度，记录OD值，计算细胞增殖率=[(实验组OD值-空白组OD值)/(对照组OD值-空白组OD值)×100%]。

1.7 Transwell实验和流式细胞学实验 取OV-CK19和OV-VC细胞接种于Transwell小室(1×105/孔)，上室加入无血清DMEM培养基，分别于下室加入10%FCS和0.1%BSA/PBS的DMEM培养基，继续培养24 h后，应用甲醛固定微孔膜下层表面的OV-CK19和OV-VC细胞，结晶紫染色后，显微镜下随机挑选5个不重复视野拍照。同时收集转移至下室OV-CK19和OV-VC细胞，流式细胞仪检测其数量。

2 结果

2.1 进展型HGSOC组织中CK19 mRNA的表达 在128例进展型HGSOC患者的CK19 mRNA相对表达量为0.54～24.03，根据X-tile分析以60.9%为cut-off值分为CK19 mRNA低表达组(78例)和高表达组(50例)。腹腔积液量>500 mL的患者中CK19 mRNA高表达占50%，而腹腔积液量≤500 mL的患者中CK19 mRNA高表达仅占32.1%，差异有统计学意义(P=0.042)。大约50.9%的铂类耐药患者CK19 mRNA高表达，而30.1%的非铂类耐药的患者CK19 mRNA高表达，差异有统计学意义(P=0.017)。见表1。CK19 mRNA的表达与进展型HGSOC患者的年龄和肿瘤残余情况无统计学相关性。

表1 HGSOC中CK19 mRNA表达和临床特征

2.2 进展型HGSOC中CK19 mRNA表达的临床意义 Kaplan-Meier生存曲线显示，CK19 mRNA高表达组的5年无进展生存期(PFS)明显降低(图1-A)，但CK19 mRNA高表达组的总生存期(OS)与CK19 mRNA低表达组差异无统计学意义(图1-B)。单因素回归分析发现，CK19 mRNA高表达的患者5年PFS低于CK19 mRNA低表达的患者(P=0.018)，但两组患者OS差异无统计学意义(P>0.05),见表2。多因素回归分析结果显示，CK19 mRNA高表达的患者5年PFS显著低于CK19 mRNA低表达的患者，并且独立于年龄、肿瘤残余、腹水量等其他风险因素(P=0.049)，见表3。

注：A: PFS; B: OS

表2 单因素回归分析HGSOC的预后因素

表3 多因素回归分析HGSOC的预后因素

2.3 卵巢腺癌细胞CK19过表达促进细胞增殖 转染后应用RT-PCR和Western blot检测，OV-CK19组的CK19 mRNA(图2-A)和蛋白(图2-B)均显著升高，而对照组(OV-VC)均无明显改变。MTT实验中，经48 h和72 h培养后，OV-CK19组细胞增殖率分别是4.41和8.66，是OV-VC组的1.21倍和1.23倍，差异有统计学意义(P<0.01),见图3。

注:A: CK19 mRNA表达水平；B: CK19 蛋白表达水平

图3 CK19过表达增加卵巢腺癌细胞增殖能力

2.4 卵巢腺癌细胞CK19过表达增加细胞侵袭性 运用Transwell小室和流式细胞学实验发现，与OV-VC细胞相比，穿过transwell微孔膜抵达下层小室的OV-CK19细胞明显增加(图4、5)，CK19过表达显著增加卵巢腺癌细胞的侵袭能力。

注：A: OV-VC细胞+0.1%BSA；B: OV-VC细胞+10%FCS；C: OV-CK19细胞+0.1%BSA；D: OV-CK19细胞+10%FCS

图5 CK19过表达增加卵巢腺癌细胞侵袭能力

3 讨论

本研究在进展型HGSOC中检测细胞CK19 mRNA的表达，CK19 mRNA 高表达的患者腹腔积液增多和铂类耐药率高，CK19 mRNA高表达是进展型HGSOC的5年无进展生存期的独立风险因素，体外实验证实CK19过表达的卵巢腺癌细胞增殖和侵袭能力明显增加，提示CK19可促进卵巢癌生长和转移，影响患者预后。

研究发现，CK19在各种上皮源性肿瘤中高表达，如甲状腺癌[8]、乳腺癌[9]和非小细胞肺癌[10]，参与肿瘤的发生和发展。Jin等[11]发现血清CK19可溶性片段的表达与上皮性卵巢癌患者肿瘤分期、病理学级别、淋巴结转移和腹腔积液有关。与该研究一致，我们在进展型HGSOC中验证CK19 mRNA表达与患者腹腹腔积液量相关。同时，我们发现CK19 mRNA高表达的患者铂类耐药率高，CK19 mRNA高表达的HGSOC患者5年PFS低于CK19 mRNA低表达患者。Wu等[12]发现CK19可溶性片段和CA125的表达增加与卵巢癌淋巴结转移和铂类耐药相关，CK19可溶性片段高表达的患者OS和PFS均降低，佐证了本研究结果。

我们通过MTT实验证实CK19过表达可增加卵巢腺癌细胞OVMZ-6增殖能力。Lu等[13]在卵巢腺癌细胞SKOV-3中过表达CK19，发现CK19可激活Wnt/β-catenin信号通路，引起卵巢癌细胞增殖增加。研究认为CK19参与多种肿瘤的发生和发展。Saha等[14]在结肠癌的研究中发现，CK19可与β-catenin/RAC1复合物，进而促进结肠癌细胞增殖。在肝癌细胞中过表达CK19可增加细胞增殖和抑制细胞凋亡[6]。我们进一步实验发现CK19过表达促进卵巢腺癌细胞侵袭，使穿越Matrigel膜的卵巢腺癌细胞增多。Govaere等[15]在肝细胞癌细胞Huh-7D12中敲降CK19后，肝癌细胞侵袭和转移能力下降，提示CK19可能促进癌细胞侵袭和迁移。Saha等[16]发现乳腺癌细胞中CK19可直接与β-catenin/RAC1复合物结合，介导下游NUMB相关性Notch信号通路，激活肿瘤细胞侵袭和转移。在卵巢癌细胞SKOV-3的研究中，CK19可上调β-catenin、C-myc和cyclinD1，进而促进卵巢癌细胞侵袭和迁移[13]。Wang等[17]发现CK19过表达可激活甲状腺癌细胞上皮间质化，促进肿瘤细胞侵袭和迁移。因此，CK19可通过介导下游信号通路影响卵巢癌细胞增殖、侵袭和迁移，但其涉及的具体分子机制仍需要进一步实验验证。

本研究旨在探讨CK19 mRNA的表达与进展型HGSOC的临床特征和预后之间的关系，由于样本收集的年代跨度较大，手术和化疗水平的改进，可能导致统计学偏倚；另外，本研究未就正常卵巢组织中CK19 mRNA的表达情况进行分析；上述问题均有待开展进一步研究。

综上所述，进展型HGSOC中CK19过表达与铂类耐药和5年无进展生存期相关，CK19过表达可促进卵巢腺癌细胞增殖和侵袭。由于CK19过表达可引起患者血清CK19可溶性片段CYFRA21-1表达水平增加，可为进展型HGSOC预后评估和靶向治疗提供新的思路。

利益相关声明：本文所有作者声明无相关利益冲突。

作者贡献说明：祝彩霞参与酝酿和设计实验，分析解释数据；起草论文；统计分析。袁林静参与实施研究，采集数据；获取研究经费。杨娟参与实施研究，采集数据；统计分析。牛刚参与酝酿和设计实验；对论文的知识性内容做批评性审阅；指导工作。