犬源牛犬细小病毒和犬圆环病毒二联PCR检测方法的建立及应用

2022-03-30于永乐姚延珠韩先杰张传美秦志华杨瑞梅张洪亮刘维全

畜牧兽医学报 2022年3期

于永乐，姚延珠，韩先杰，张传美，秦志华，杨瑞梅，张洪亮，刘维全，单虎*

(1.青岛农业大学动物医学院山东省预防兽医学重点实验室，青岛 266109；2.青岛农业大学植物医学学院，青岛 266109；3.中国农业大学生物学院农业生物技术国家重点实验室，北京 100193)

犬源牛犬细小病毒(canine bocavirus, CBoV)属于细小病毒科(Parvoviridae)、细小病毒亚科(Parvovirinae)、牛犬细小病毒属(Bocaparvovirus)的成员，为单链线状DNA病毒，CBoV的基因组大小约为5.4 kb，在结构蛋白和非结构蛋白编码区之外存在第三个开放阅读框，编码NP蛋白[1-3]。目前，已经发现3种不同亚型的犬源牛犬细小病毒，即CBoV-1、CBoV-2和CBoV-3[4-7]。

犬圆环病毒(canine circovirus, CCV)属于圆环病毒科(Circoviridae)、圆环病毒属(Circovirus)的成员，基因组为环状单链DNA，包含两个大的开放阅读框，其中，一个编码Rep蛋白，另一个编码Cap蛋白[8]。CCV往往导致肠炎、肺炎、坏死性血管炎等相关疾病，但是在健康犬的粪便中也发现了该病毒的存在，因此，迄今为止，对于CCV的致病机制尚不清楚[9]。

CBoV和CCV均可以导致犬腹泻相关疾病，在我国已有多篇报道，但能同时检测上述两种病原的多重PCR检测方法尚未见报道。本研究成功建立了可同时检测CBoV和CCV的二联PCR诊断方法，并对山东地区送检的病料进行了实际验证，证实了该方法的可靠性，可用于临床样品的快速筛查。

1 材料与方法

1.1 标准毒株及质粒

犬细小病毒2a亚型(canine parvovirus type 2a, CPV2a)CPV-QN5株、犬瘟热病毒(canine distemper virus, CDV)CDV-QN1株及犬副流感病毒(canine parainfluenza virus, CPIV)CPIV-QN1株均由本实验室分离、保存。

质粒：pMD-CBoV-NS1和pMD-CCV-Rep均由本实验室构建、保存，将质粒浓度调整为30 ng·μL-1。

1.2 临床病料

送检的病料来自山东某地养殖场发病犬肛拭子，共计30份。按照1∶9的比例加入灭菌PBS缓冲液充分振荡溶解，5 000 r·min-1离心5 min，取上清液保存备用。

1.3 主要试剂

D1000 plus DNA Ladder、2×primeSTAR Max Premix购自北京宝生物(TaKaRa)工程有限公司；QIAEX II胶回收试剂盒购自上海玉博生物科技公司；质粒小量快速提取试剂盒购自艾德莱生物科技有限公司。

1.4 二联PCR引物设计与合成

根据GenBank中CBoVNS1基因和CCVRep基因序列，利用Primer Primier 5软件，设计两对二联PCR引物，引物由青岛志远生物工程有限公司合成，引物序列：CBoV-P1(5′-GTGATGGGCGGTGACGGCTTGA-3′)，CBoV-P2：(5′-CTGGTAGA-CGCAGCCGATGAGA-3′)；CCV-P3(5′-GAAAA-TGGTGGGACGGTTACGAT-3′)，CCV-P4(5′-CAAAGTGAGACGCCGATAGAGGG-3′)；上述引物预期扩增目的片段大小分别为170(CBoV)和239 bp(CCV)。

1.5 病料DNA模板制备

分别将CBoV和CCV的临床病料300 μL置于离心管中，沸水浴 10 min 后，迅速冰浴2 min，然后用微量离心机于室温以 8 500 r·min-1离心6 min，吸取上清液用于后续PCR反应。

1.6 二联PCR扩增方法的建立及优化

所有PCR反应总体积为25 μL,其中，2×primeSTAR Max Premix 12.5 μL，不同引物终浓度(0.10、0.15、0.20、0.25、0.30 μmol·L-1)，质粒模板1 μL，ddH2O 10.5 μL。PCR条件为98 ℃预变性5 min；98 ℃变性10 s，不同退火温度(52、54、56、58、60 ℃)退火10 s，72 ℃延伸10 s，30个循环；72 ℃延伸1 min。取6 μL PCR扩增产物在2.5%的琼脂糖凝胶上进行电泳，观察并照相，确定其最适引物浓度和退火温度，并对所有扩增产物进行胶回收，目的片段送公司测序验证。

1.7 二联PCR扩增试验

在二联PCR反应体系中，各病毒引物终浓度：CBoV 0.10 μmol·L-1、CCV 0.20 μmol·L-1。二联PCR反应退火温度确定为58 ℃，其他条件与“1.6”一致，分别对上述质粒模板进行检测。

1.8 二联PCR重复性、特异性和敏感性试验

按照“1.7”的方法，进行二联PCR重复性和特异性检测。将CBoV与CCV质粒的10-1、10-2、10-3、10-4、10-5和10-6倍稀释度的DNA模板组合，进行二联PCR灵敏度检测。

1.9 二联PCR对送检病料的检测

以已建立的二联PCR对送检的30份病料进行检测，并与单项PCR检测结果进行比较分析。

2 结果

2.1 二联PCR扩增试验

由图1可知，应用优化后的最佳反应体系和条件，二联PCR一次性成功扩增出170 bp(CBoV)和239 bp(CCV)的2条目的条带(图1)，经测序证实，所有扩增的片段与CBoV和CCV相应基因序列高度一致。

图1 二联PCR扩增结果

2.2 二联PCR重复性、特异性和灵敏度

由图2A可知，二联PCR重复3次均可以获得一致的扩增结果，而且与犬相关的3种病毒——CPV-2、CDV和CPIV检测结果均为阴性，证明该方法具有很高的特异性(图2B)；灵敏度试验结果显示，二联PCR至少可检出约3.0 pg DNA(图2C)。

A～C.重复性、特异性和灵敏度试验结果；M.DNA相对分子质量标准；ddH2O.阴性对照；10-1～10-6.稀释度

2.3 二联PCR对临床病料的检测

在30份送检样品中，应用二联PCR方法进行检测，结果如图3所示，其中，CBoV阳性4份，CCV阳性3份。与单项PCR检测结果完全一致(图3)。

M.DNA相对分子质量标准；1～30.样品；ddH2O.阴性对照；P.阳性对照

3 讨论

CBoV和CCV是导致犬腹泻病的两种重要病原体，在我国已有多篇报道，但目前对于两种病毒的致病机制及流行情况尚不清楚，因此建立快速诊断方法，加强对两种新发病原的检测十分必要。陈意伟等[10]于2016年首先建立了CBoV的PCR检测方法，曹亮等[11]于2017年建立了可同时检测犬圆环病毒和犬细小病毒的双重PCR检测方法，以上研究对两种病毒的流行情况均进行了详细的描述。Niu(牛江婷)等[12]报道在1只猫粪便中检测到CBoV的核酸，经比对分析发现猫源CBoV与犬源CBoV具有相同的基因结构，提示CBoV已经具有了跨物种传播的能力，因此，加强对CBoV的流行病学监测十分必要。而且近年来CCV感染的报道也逐渐增多，从重庆[13]到黑龙江[14]均有不同程度病例出现，可见CCV流行范围较广。此外，一种新发病原猪圆环病毒3型(porcine circovirus 3，PCV 3)在犬的腹泻及血清样本中检到[15]，提示在对犬临床样本检测过程中，也要增加对PCV 3等跨宿主感染和传播的病原进行检测，才能获得更加准确的研究结果。

随着CBoV与CCV感染的病例不断出现[7]，迫切需要更加快速、简便的检测方法用于临床实际，而且国内尚未有CBoV和CCV二联PCR检测方法的报道，限制了对两种新发犬腹泻病的流行情况的监测。本研究在前人研究的基础上，通过多重序列比对、反应体系及条件优化，经反复试验后建立了更加简便快捷的双重PCR方法，其操作简单，灵敏度更高，可完全满足临床检测要求。