基于RANKL/RANK/OPG通路研究绝经后老年骨质疏松患者骨代谢与肠道菌群失调的关系

宋 昕，孙 莹，张 琦，耿 涛

(应急总医院干部疗养科，北京100020)

骨质疏松症是一种全身性骨代谢疾病，主要表现为骨密度降低、骨微结构破坏，增加骨折发生的风险，是世界公共卫生的重大问题之一[1]。患者以女性居多，绝经后骨质疏松症的发生率超过35%，严重影响老年女性生活质量和生命安全[2]。肠道菌群是人体内最大的生态系统，近年来随着研究的深入发现肠道菌群失调与肿瘤、炎症、糖尿病等疾病的发生具有密切联系[3]，而肠道菌群失调能够通过调节机体免疫、激素水平以及骨代谢等方式促进骨质疏松症的发生和进展，是导致老年女性骨质疏松症的重要因素[4]。研究表明，核因子κB受体活化因子配体(receptor activator of nuclear factor-κB ligand，RANKL)-核因子κB受体活化因子(receptor activator of nuclear factor-κB，RANK)-骨保护素(osteoprotegerin，OPG)通路在维持骨吸收与骨形成的平衡中发挥重要作用，外源性OPG具有延缓骨质流失的作用[5]。但目前肠道菌群失调通过RANKL/RANK/OPG信号通路调节骨代谢影响骨质疏松症发生发展的研究尚不完全明确，本研究通过对绝经后老年骨质疏松患者骨代谢与肠道菌群失调的关系进行研究，旨在为老年女性骨质疏松症的预防和治疗提供相关依据。报告如下。

1 资 料 与 方 法

1.1一般资料 选取2019年1月—2021年1月于我院就诊的老年骨质疏松老年女性患者177例为研究对象，骨质疏松诊断依据《绝经后骨质疏松的影像学表现及诊断标准》[6]，所有患者行肠道细菌涂片培养后计算双歧杆菌/肠杆菌值，根据《肠道菌群失调诊断治疗建议》[7]将患者分为研究组(肠道菌清失调，双歧杆菌/肠杆菌<1，78例)和对照组(肠道菌群未失调，双歧杆菌/肠杆菌>1，99例)。2组患者均为绝经后女性，研究组年龄53～75岁，平均(62.15±8.21)岁、对照组年龄52～75岁，平均(62.21±7.13)岁；认知功能正常、生活能力正常、临床资料完整，无合并恶性肿瘤、自身免疫性疾病、重要脏器功能障碍及精神神经疾病。

本研究经医院医学伦理委员会审核通过,所有患者及家属均知情同意并签署知情同意书。

1.2肠道菌群的分离及鉴定 所有患者入组后收集1 g左右新鲜粪便于洁净容器中，采用10倍稀释法进行稀释后进行培养，使用法国梅里埃公司VITEK2 Compact全自行微生物鉴定系统检测微生物分布情况，主要检测粪便中双歧杆菌和肠杆菌，结果采用(lg菌落数/g)表示。见表1。

表1 2组肠道菌群比较Table 1 Comparison of intestinal flora between two groups 菌落数/g)

1.3炎症因子及骨代谢指标水平检测 患者入组后次日清晨空腹抽取静脉血5 mL于无菌管中，3 000 r/min离心10 min收集上层血清，采用酶联免疫吸附法(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)试剂盒检测血清中白细胞介素6(interleukin-6，IL-6)、肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)、转化生长因子β1(transforming growth factor-β1，TGF-β1)、血清骨钙素(osteocalcin，OC)、骨特异性碱性磷酸酶(bone-specific alkaline phosphatase，BALP)、25-羟维生素D[25-hydroxyvitamin D，25(OH)D]、抗酒石酸盐酸性磷酸酶5b(tartrate resistant acid phosphatase-5b，TRACP-5b)等骨代谢指标水平，严格按照试剂盒说明书所述步骤进行，血清ELISA试剂盒购自美国Thermo Fisher公司。

1.4RANKL/RANK/OPG通路蛋白水平检测 无菌抽取患者膝关节囊内关节液于无菌管中，加入RIPA蛋白裂解液于冰上裂解40 min，12 000 r/min离心10 min后吸取上清，采用BCA蛋白定量检测试剂盒进行校准，加入4×Loading Buffer煮样后进行聚丙烯酰胺-凝胶电泳，电泳结束将蛋白转入PVDF膜中，封闭1 h后加入1∶1 000稀释的一抗于4 ℃条件下孵育过夜，次日再加入二抗室温孵育1 h，检测RANKL、RANK、OPG蛋白表达水平，以GAPDH最为内参，以目标蛋白灰度值/内参灰度值为蛋白相对表达量，RANKL、RANK、OPG兔抗人一抗均购自美国CST公司，BCA蛋白定量检测试剂盒购自美国Thermo Fisher公司，辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔二抗及Western-blot试剂盒购自北京中杉金桥生物有限公司，Simon 全自动Western-blot监测分析仪购自美国ProteinSimple公司。

1.5统计学方法 应用SPSS 21.0统计软件分析数据。计量资料比较采用两独立样本的t检验，相关性采用Spearman相关性分析法。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.12组患者血清炎症因子水平比较 研究组患者血清IL-6、TNF-α、TGF-β1水平明显高于对照组，差异有统计学意义(P<0.05)，见表2。

2.22组患者血清骨代谢指标比较 研究组患者血清OC、BALP、TRACP-5b水高于对照组，血清25(OH)D水平低于对照组，差异有统计学意义(P<0.05)，见表3。

2.32组关节液RANKL/RANK/OPG通路相关蛋白表达情况比较 研究组患者关节液中RANKL、RANK蛋白相对表达量高于对照组，OPG蛋白相对表达量低于对照组，差异有统计学意义(P<0.05)，见表4。

表2 2组IL-6、TNF-α、TGF-β1水平比较Table 2 Comparison of IL-6，TNF-α，and TGF-β1 levels between two groups

表3 2组血清OC、BALP、TRACP-5b、 25(OH)D水平比较Table 3 Comparison of serum OC,BALP, TRACP-5b and 25(OH)D levels between two groups

表4 2组关节液RANKL、RANK、OPG蛋白 相对表达量比较Table 4 Comparison of the relative expression of RANKL, RANK and OPG protein in synovial fluid between two groups

2.4研究组肠道菌群和骨代谢指标的相关性 研究组双歧杆菌与血清25(OH)D水平呈正相关(r=0.332，P<0.05)，与血清OC、BALP和TRACP-5b水平呈负相关(r=-0.318、-0.408、-0.371，P<0.05)；肠杆菌与血清25(OH)D水平呈负相关(r=-0.378，P<0.05)，与血清OC、BALP和TRACP-5b水平呈正相关(r=0.356、0.343、0.364，P<0.05)。

3 讨 论

骨质疏松症是常见的骨质退化性疾病，随着我国人口老龄化的加重骨质疏松症患者也日益增多，骨密度降低导致的骨量水平降低是其主要临床表现，增加患者骨折风险[8]。骨代谢过程包括旧骨吸收和新骨形成2个过程，儿童以及青少年使其骨形成过程大于骨吸收，使骨骼增长迅速，骨容量在30岁左右达到峰值。而在女性绝经以及男性50岁之后，骨吸收过程大于骨形成，使得骨量减少，骨质脆性增加，导致骨质疏松的发生和发展。老年女性绝经后骨质疏松症又称Ⅰ型原发性骨质疏松症，雌激素水平大量下降是导致其发生的重要原因[9]。雌激素能够与破骨细胞内雌激素受体结合促进降钙素分泌，同时减少骨吸收水平，促进骨质重建和生成，而雌激素减少后不仅上述过程减弱，还促进RANKL水平升高，促进破骨细胞生长分化，导致骨吸收增强，使骨强度下降，骨量降低[10]。近年来研究表明，肠道菌群失调能够导致骨代谢异常，骨质疏松症患者粪便标本中放线菌属、蛋鸡菌属和梭状芽孢杆菌属丰度增加，不仅通过调控骨代谢和维生素D的吸收调控骨质生长，还能够通过分泌瘦素、OPG等激素参与骨的代谢，是导致骨密度降低、骨脆性增加的重要因素[11-12]。

本研究结果显示，研究组血清OC、BALP、TRACP-5b水平明显升高，25(OH)D水平明显降低，且肠道双歧杆菌与25(OH)D水平呈正相关，与OC、BALP和TRACP-5b水平呈负相关，而肠杆菌则与25(OH)D水平呈负相关，与OC、BALP和TRACP-5b水平呈正相关，提示肠道菌群失调能够引起骨代谢异常，可能是导致骨质疏松的重要因素之一。

研究表明，RANKL/RANK/OPG通路与骨代谢密切相关，RANKL与RANK相结合后促进c-Fos蛋白表达增多，与活化T淋巴细胞结合后促进破骨细胞生成相关特异性基因表达增强，促进破骨细胞的生长和分化并抑制其凋亡，增强骨破坏进程，使得骨吸收活性增强[13]。而OPG能够竞争性与RANK相结合，且结合能力较RANKL更强，从而有效阻止破骨细胞反应的传导，在破骨细胞形成和分化过程中发挥负性调节作用[14-16]。本研究结果显示，研究组关节液中RANKL、RANK水平明显升高，OPG水平明显降低，提示肠道菌群可能通过调控RANKL/RANK/OPG通路减少OPG表达，促进破骨细胞生长分化，有利于骨吸收和骨破坏的发展，可能是导致老年女性骨质疏松的原因之一。

炎症反应也是导致骨质疏松症的重要原因，如通过增强免疫反应、促进氧化应激、加剧炎症反应程度等途径影响骨代谢微环境，促进破骨细胞的增殖和分化促进骨质代谢，促进骨质疏松症的发生和进展[17-18]。炎症因子还能够作用于成骨细胞，通过激活核因子κB等信号通路负性调节成骨细胞分化、抑制Wnt/β-catenin通路抑制Sema3B蛋白表达等途径抑制成骨细胞的分化和生长，导致骨质疏松症的发生[19-21]。本研究结果显示,研究组血清IL-6、TNF-α、TGF-β1水平明显高于对照组，提示肠道菌群失调可能通过调节机体炎症因子水平促进骨质疏松症的发生。

综上所述,肠道菌群失调的老年女性血清OC、BALP、TRACP-5b升高,25(OH)D水平降低，关节液内RANKL、RANK蛋白表达增多，OPG蛋白表达减少，血清炎症因子水平升高，促进了骨质疏松症的发生和进展。本研究的不足之处在于样本量较少，且纳入研究的患者时间跨度较小，可能导致研究结果存在一定程度的偏倚，需要在后续的研究中进一步扩大样本量以及研究时间跨度，以减少研究误差，使研究结果更具有科学依据。