慢性睡眠剥夺对大鼠髁突软骨TGF-β1表达的影响

赵 琛，刘 阳，崔玉兰*，白月辉，李明阳

(1.河北医科大学口腔医学院，河北省口腔医学重点实验室，河北省口腔疾病临床医学研究中心，河北医科大学 口腔医院修复科，河北 石家庄 050017；2.河北医科大学口腔医学院，河北 石家庄 050017)

颞下颌关节紊乱病(temporomandibular disorders,TMD)是以疼痛、下颌运动异常和弹响三大临床特征为主的口颌面系统的常见病。其致病因素较多，目前临床认为咬合和心理因素是其主要致病因素[1]。有研究认为睡眠障碍会对TMD的发生发展产生作用，很多患者在诊断为TMD之前都有过不良的睡眠经历[2]。改良多平台法(modified multiple platform method，MMPM)是一种常用的，操作方便的建立睡眠剥夺的方法，研究证明经过慢性睡眠剥夺的动物会变得烦躁、焦虑不安，进而引起心理上的应激状态[3]。转化生长因子β(transforming growth factor-β，TGF-β)是一种调节软骨细胞分化、增殖的生长因子，参与了软骨细胞生长发育和修复改建的过程[4]。然而，TGF-β在慢性睡眠剥夺引起的髁突病理性改变及改建中如何表达尚未有相关研究。本实验拟通过MMPM法建立大鼠慢性睡眠剥夺模型，研究慢性睡眠剥夺大鼠髁突软骨中TGF-β1的表达变化。

1 材 料 与 方 法

1.1实验动物 Wistar 大鼠60只，雄性，8周龄，体重(220±10) g，购自河北省实验动物中心(许可证号：SCXK冀2018-004)。大鼠先于河北医科大学口腔医院省重点实验室适应性饲养1周，每天将大鼠放置于水箱中30 min以适应水环境，消除大鼠对于水环境的恐惧。将60只大鼠随机分为实验组、对照组和恢复组。实验组大鼠接受1、2、3、4周睡眠剥夺后处死取材，恢复组在接受1、2、3、4周睡眠剥夺后笼养1周恢复睡眠，再处死。

本实验所有操作均符合河北医科大学动物实验伦理委员会要求。

1.2实验试剂与仪器 兔抗鼠TGF-β1一抗(美国Affinity Biosciences.OH公司)，通用二步法试剂盒(北京中山金桥)，MMPM实验水箱、对照水箱(自制)，旷场实验箱(自制)，组织包埋机(樱花Tissue-Tek TEC5，美国)，超薄石蜡切片机(LEICA, 德国)，光学显微镜(OLYMPUS，日本)、多功能照相显微镜(OLYMPUSBX-63，日本)。

1.3慢性睡眠剥夺模型的建立 本实验选择MMPM建立慢性睡眠剥夺的大鼠模型。自制长宽高为110 cm×70 cm×40 cm的水箱，水箱内置15个6.3 cm直径，8 cm高的小平台，每个平台间隔距离为15 cm。将水箱内注满水，水面低于小平台下1 cm，水温保持在(20±2)℃，大鼠在小平台上可自行进食，饮水。实验室温度控制在23～29 ℃，每天日光灯照射12 h后关灯黑暗12 h。小平台组每日下午16∶00放入水箱内进行睡眠剥夺，次日上午10∶00取出放回鼠笼中。对照组与实验组处理方法相同，区别于在小平台上置金属网，大鼠可在金属网上自由活动及进行睡眠。对照组大鼠由于在小平台上放置金属网，允许快速动眼睡眠的发生，同时排除水环境等其他因素对实验的干扰。

1.4慢性睡眠剥夺评价 所有大鼠在慢性睡眠剥夺结束后均进行旷场实验。旷场箱是长宽高为100 cm×50 cm×50 cm的立方体实验箱，箱壁不透明。箱底分为25个面积相等的正方形格子(边长20 cm)。在旷场上方固定摄像设备记录大鼠5 min内的活动情况。实验时将摄像设备放置于旷场上方中央记录大鼠水平活动得分、垂直活动得分。水平得分为跨越一格记1分(三爪及以上)，垂直得分为双前肢同时离地抬起为1分。保证每一次实验环境，如隔音、光强度、湿度、温度等一致。实验过程中禁止实验人员被大鼠看到，抓取等操作轻柔切忌暴力，保持安静，以免对大鼠行为产生干扰。旷场实验开始前将大鼠放置于实验箱中适应环境2 min，每只大鼠放入旷场中均面部朝向下方，背对实验人员，且都放在旷场正中央位置。因大鼠活动度有时间性变化，故实验统一选择中午12∶00时进行，每只大鼠仅进行1次实验。实验后用75%酒精棉球擦拭箱底及侧壁，清除大鼠排泄物，彻底干燥(约5 min)，以防止大鼠留下的气味干扰后续实验。

1.5大鼠TMJ标本制取 用过量10%水合氯醛(3 mL/kg)腹腔注射麻醉大鼠，用75%酒精消毒大鼠头部及颈部，采用断颈方法处死大鼠。剥离大鼠头部皮肤后剔除咬肌，颞肌等颞下颌关节周围肌肉，完整取出双侧颞下颌关节(含关节窝、关节盘、下颌髁突及关节囊)。取出双侧颞下颌关节组织块后置于4%多聚甲醛固定24 h。采用10%乙二胺四乙酸溶液脱钙1个月(每1～2 d更换一次脱钙液)，以探针穿刺骨组织无阻力感，可以穿透组织为脱钙完成标准。

1.6HE染色 脱钙完成后流水下冲洗过夜，梯度酒精脱水，浸蜡包埋(包埋时注意方向，髁突矢状向平行于蜡块底部，髁突外侧朝外)。包埋完成后由关节外侧向内侧连续进行矢状向切片，切片厚度为4 μm，37 ℃展片仪捞片，55 ℃烘片2 h备用。石蜡切片脱蜡至水：二甲苯Ⅰ液12 min，二甲苯Ⅱ液12 min，无水乙醇2 min，95%乙醇溶液2 min，85%乙醇溶液1 min，75%乙醇溶液1 min，流水冲洗。苏木素溶液5 min，流水冲洗。盐酸酒精分化1～2 s，流水冲洗。1%氨水反蓝30 s，流水冲洗。伊红溶液30 s，流水冲洗。75%乙醇溶液3 min，85%乙醇溶液3 min，95%乙醇溶液10 min，无水乙醇10 min。二甲苯5 min。封片。

1.7免疫组织化学染色 脱蜡与水化：二甲苯10 min×3次，无水乙醇10 min×3次，95%乙醇溶液3 min×2次，85%乙醇溶液3 min×2次，75%乙醇溶液3 min×2次，蒸馏水冲洗1 min，置于PBS缓冲液溶液中。抗原修复：将胃蛋白酶溶液滴到载玻片组织上，37 ℃恒温箱内孵育30 min。PBS缓冲液冲洗3 min×3次。阻断内源性过氧化物酶：将内源性过氧化物酶阻断剂(SP-9001)滴加到载玻片组织上，室温孵育20 min。PBS缓冲液冲洗3 min×3次。滴加一抗：滴加适量一抗(TGF-β1 1∶50)到载玻片的组织上，37 ℃孵育60 min。PBS缓冲液冲洗3 min×3次。滴加反应增强液：将适量反应增强液(SP-9001)滴加到载玻片组织上，室温反应20 min。PBS缓冲液冲洗3 min×3次。滴加酶标山羊抗小鼠/兔IgG聚合物：将酶标山羊抗小鼠/兔IgG聚合物滴加到载玻片的组织上，室温孵育20 min，PBS缓冲液冲洗3 min×3次。显色：配制DAB显色液，滴加到载玻片组织上，反应6 min，镜下观察染色。复染：自来水冲洗，苏木素染色液染色30 min，流水冲洗，盐酸酒精分化1～2 s，流水冲洗，氨水反蓝30 s。脱水，透明，封片：75%乙醇溶液1 min，85%乙醇溶液1 min，95%乙醇溶液10 min，无水乙醇10 min，二甲苯5 min。中性树胶封片。

1.8图像采集与分析 利用OlympusBX-63显微镜观察组织，使用显微镜配套相机系统及软件拍摄图像。HE染色图像的照片选取整个髁突表面采集，免疫组织化学图像选择髁突中1/3与后1/3交界处的髁突软骨(髁突软骨对应关节盘中间带处)，每张切片在该处随机截取3个×400倍镜下的视野(截取部位见图1)，对所选取的每个区域中阳性细胞个数进行求和，取3个视野平均值作为阳性细胞表达强度。

图1 图像采集区域：髁突中1/3与后1/3交界处(SP ×400)

1.9统计学方法 应用SPSS 23.0统计软件对数据进行分析。计量资料比较采用单因素方差分析和SNK-q检验。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1旷场实验 旷场实验结果显示实验组与恢复组结束睡眠剥夺时旷场实验结果水平得分和垂直得分均高于对照组(P<0.05)，见表1，2，证明睡眠剥夺建模成功。恢复组在恢复睡眠1周后测试旷场实验结果与对照组得分差异无统计学意义(P>0.05)，说明恢复组大鼠在恢复正常睡眠1周后已不再处于应激状态。

表1 旷场实验垂直得分Table 1 Vertical score of open field experiment 分)

表2 旷场实验水平得分Table 2 Level score of open field experiment 分)

2.2软骨髁突组织结构变化 对照组髁突软骨表层光滑连续，表层纤维结构与髁突表面平行，排列紧密。髁突中部纤维软骨带约肥大细胞4～6层，细胞排列无明显规律。

实验组的髁突软骨HE染色，可以观察到髁突软骨有增龄性变化，软骨细胞层数随时间增长而逐渐减少。1周实验组与对照组髁突软骨无明显差别，2周实验组细胞分层逐渐变得不清晰，增殖带的小细胞有向下侵入圆形软骨细胞层的现象发生。3周实验组的这种现象更加常见， 4周实验组还可以观察到软骨表层细胞间发生裂隙，软骨深层与软骨下骨界限不明显。

恢复组与实验组相比，表层纤维带的裂隙减小，或是部分裂隙被纤维样组织占据但内部尚无细胞长入。局部纤维软骨带细胞层数较周围明显增多，但细胞界限清晰，纤维软骨带中的圆形软骨细胞增多，层数增加(图2～4)。

2.3TGF-β1免疫组织化学染色结果 TGF-β1在增殖带软骨细胞和纤维软骨带的圆形软骨细胞中有阳性表达，阳性细胞呈现包括胞浆与细胞外基质在内的棕黄色染色(图5)。

对照组TGF-β1可见在髁突软骨增殖层中表达，表达强度随实验时间的延长并未出现明显变化，1、2、3、4周组之间表达差异无统计学意义(P>0.05)。

实验组1、2、3、4周组间TGF-β1的表达随实验时间的延长而增多，与相应的对照组差异有统计学意义(P<0.05)。1周组表达部位位于增殖层细胞中，随睡眠剥夺时间延长，深层肥大软骨细胞逐步开始表达TGF-β1，且染色加深。

恢复组1、2、3、4周的TGF-β1表达较相对应实验组减少(P<0.05)。睡眠剥夺1周恢复组TGF-β1表达较对照组差异无统计学意义(P>0.05)，睡眠剥夺2、3、4周时TGF-β1阳性细胞较对照组增多，差异有统计学意义(P<0.05)，见表3。

表3 TGF-β1在髁突软骨的阳性细胞个数 Tab3 The number of positive cells of TGF-β1 in condylar cartilage

3 讨 论

研究TMD病理机制的动物模型有很多，根据TMD疾病的致病因素，可分为通过改变咬合使关节负荷增大建立TMD模型，通过化学药物注射建立TMD模型，通过外科手术切除关节盘建立模型或是通过基因工程等方式建立模型[5]。但随着对TMD病因中心理因素的深入研究，尤其是睡眠障碍这一病因的探究，需要一种能广泛应用于鼠类这种常用实验动物的睡眠剥夺模型建立的方法。因此本研究的实验组采用MMPM建立慢性睡眠剥夺模型的Wistar大鼠模型。MMPM法是一种干扰因素可控，建模效果明显的睡眠剥夺方法，被广泛应用于研究慢性睡眠剥夺引起动物应激状态的实验[2]。

旷场实验常用于验证慢性睡眠剥夺模型建立是否成功，旷场实验可以验证实验动物自主运动行为、焦虑、抑郁程度。本实验参考已有相关实验的结果参数进行设定与分析，选择记录水平跨格数、直立次数综合考虑评价，已有研究认为水平跨格数、直立次数的增加，表明实验动物受睡眠剥夺导致的应激反应强烈[6]。本实验结果显示睡眠剥夺组在相同时间点的行为学记录得分均高于对照组，证明慢性睡眠剥夺模型建立成功，对大鼠产生了较强的应激刺激。同时本实验不同于以往研究，设计恢复组探讨慢性睡眠剥夺成功后对实验动物恢复正常睡眠，可否引起不同变化。该组大鼠在完成各时间点的睡眠剥夺后，立即进行旷场实验，所得结果与对照组相比均有统计学意义，说明建模成功。恢复组大鼠在完成睡眠剥夺后恢复正常睡眠1周，再进行旷场实验，此时恢复组大鼠得分与对照组得分相比差异无统计学意义，说明大鼠在恢复1周睡眠后，其应激状态得到了一定的缓解。

正常的下颌髁突表面由一层纤维软骨构成，根据软骨内各部分结构的差异，可将髁突软骨由表面向内分为4个带：纤维带、增殖带、纤维软骨带和钙化软骨带。纤维带位于表面排列紧密整齐，纤维走形方向与软骨表面平行，下层是具有小而密集细胞的增殖带，再深层是包含圆形软骨细胞的纤维软骨带，钙化软骨带位于最深层与软骨下骨相连。正常情况下各层细胞界限清楚，结构排列整齐。本实验中发现经过慢性睡眠剥夺，实验组大鼠髁突表层纤维出现裂隙、断裂，细胞界限不清，软骨下骨向软骨层长入等退行性改变，与已有实验结果相同[7-8]。恢复组与实验组相比，髁突表层纤维带裂隙减少，局部肥大细胞层数有增加，各层细胞界限较清晰，说明经过1周睡眠恢复，髁突软骨退行性改变症状有了一定改善。

TGF-β是一类在骨形成和骨改建过程中起重要调控作用的细胞因子，包含 TGF-β1、TGF-β2、TGF-β3等多个成员，近年来大量实验证明，TGF-β可在一定程度上促进骨的修复再生[9-11]。TGF-β可以促进软骨细胞的增殖和分化，并控制细胞外基质的合成和降解。有研究认为TGF-β在生长发育期表达增加，随着生长发育停止而逐渐减少[12]。本实验中对照组中TGF-β1表达呈现下降趋势，可能与增龄性变化有关。有研究将关节软骨碎块化后发现TGF-β1存在过表达的现象，且过表达的TGF-β1能够促进软骨细胞迁移,促进软骨损伤的修复[13]。有学者利用天然高分子乙烯基之间的化学作用，制备了TGF-β负载光聚合壳聚糖/丝蛋白生物水凝胶基质，观察发现可以有效的促进软骨细胞增殖，认为TGF-β可以用于软骨组织再生[14]。Wiegertjes等[15]通过收集衰老的OA样关节软骨细胞，发现TGF-β可以抑制白细胞介素6的表达，减缓关节软骨变性。因此，可以认为TGF-β对骨关节炎的发展与修复密切相关。王轲等[6]认为慢性睡眠剥夺引起大鼠应激态后，大鼠髁突微环境发生变化，导致局部炎症因子表达增加。有研究发现，在关节炎症初期，软骨受到轻微损伤引起TGF-β1表达增加，TGF-β1会增加胶原纤维、蛋白多糖的合成，修复炎症因子对微环境所造成的破坏[16]。而当关节炎症发展到一定程度时，软骨基质进一步降解，软骨细胞肥大、凋亡，TGF-β在软骨内的合成作用小于分解作用，软骨组织合成代谢的速度低于分解代谢，最终炎症向终末发展[17]。本实验中，软骨组织因慢性睡眠剥夺而发生退行性改变，软骨细胞分泌TGF-β1增加。睡眠剥夺初期未能观察到明显组织变化，直到剥夺睡眠2～3周时才发现组织内的退行性，与已有研究一致。在恢复组中，睡眠剥夺1周恢复组TGF-β1表达与对照组差异无统计学意义，提示短时间的睡眠剥夺对髁突的影响可能会随着睡眠恢复而很快恢复。睡眠剥夺2、3、4周恢复组较实验组TGF-β1表达下降可能是因为随着软骨适应性改建需求的下降，TGF-β1分泌减缓所致，但较对照组仍有显著性增高则表示髁突软骨依旧处于改建恢复过程中。恢复组在HE染色中局部的肥大软骨细胞增多，可能是由于TGF-β1对软骨细胞的分化增殖有促进作用有关。有研究表明TGF-β1过度表达会引起软骨组织的增生，尤其是肥大细胞的数量增加[18]。

通过本研究可以发现，MMPM可以引起颞下颌关节髁突软骨的退行性表现，而在此过程中TGF-β1作为一种包含软骨组织的生长因子产生了重要作用。但本实验未能从细胞和分子水平探讨其具体作用机制，还需进一步研究。(本文图见封三)