基于网络药理学和动物实验探讨红曲治疗脑小血管病的作用机制

孙纪，苏恒，聊晓玉，桂文琪，方媛，韩岚*，彭代银*（1. 安徽中医药大学药学院，合肥 230000；2. 中药复方安徽省重点实验室，合肥 230000；3. 安徽道地中药材品质提升协同创新中心，合肥230000；. 安徽康和中药科技有限公司，安徽 亳州 236000）

脑小血管病（CSVD）是直径介于40～200 μm的脑血管病变引起的综合征[1]，临床表现为脑白质病变、脑微出血、腔隙性梗死等[2]。研究表明，CSVD与痴呆、卒中等疾病关系密切，约有45%的血管性痴呆和20%的缺血性卒中由CSVD引起[3]。西医治疗CSVD主要通过溶栓药、降压药、抗血小板等早期干预，效果不佳且不良反应较大。中医理论认为CSVD属“络病”范畴，治法为扶正祛邪，中药治络病效果显著，不良反应较少，已成为近年来的研究热点。

红曲（red yeast rice，HQ）为药食两用中药，生产历史悠久，药用记载始于《饮膳正要》[4]。2020年版《中国药典》[5]记载红曲为紫色红曲霉Monascus purpureusWent寄生于粳米发酵而得。其味甘，性温，无毒，归肝、脾经，有活血化瘀、通经活络功效。现代药理研究表明，红曲成分中MonacolinK及其衍生物、红曲色素、γ-氨基丁酸等具有显著的降血脂、降血压、神经保护、改善微循环等作用[6-7]，提示红曲可作为治疗CSVD的潜在药物。

网络药理学是基于生物信息学、药理学等的综合性学科，通过构建生物分子互作网络，系统化诠释分子作用机制[8]。因此，本研究基于网络药理学研究方法构建红曲“药物-成分-靶点”网络，获取相关成分、靶点、通路信息，通过动物实验对网络药理学结果进行验证，探讨红曲治疗CSVD的物质基础和分子机制。

1 资料与方法

1.1 网络药理学

1.1.1 数据库及软件 TCMSP（https：//tcmsp-e.com/）、SwissTargetPrediction数 据 库（http：//www.swisstargetprediction.ch/）、GeneCards数 据库（https：//www.genecards.org/）、OMIM数 据库（https：//omim.org/）、CTD数据库（https：//ctdbase.org/）、DisGeNET数据库（https：//www.disgenet.org/）、Uniprot（https：//www.uniprot.org/）、STRING 11.0数 据 库（https：//string-db.org/）、DAVID 6.8数据库（https：//david.ncifcrf.gov/home.jsp）、CytoScape 3.7.1软件。

1.1.2 红曲成分及作用靶点收集 通过PubChem、SwissTargetPrediction及文献收集红曲成分，根据里宾斯基五规则进行筛选。将红曲成分文件上传至SwissTargetPrediction数据库，选择物种为“Homo sapiens”，获取红曲作用靶点，并对靶点进行去重整合。

1.1.3 CSVD疾病靶点筛选 将“Cerebral Small Vessel Disease”输入GeneCards数据库、OMIM数据库、CTD数据库、DisGeNET数据库寻找CSVD疾病靶点。

1.1.4 交集靶点Venny分析 登入Venny 2.1网站，将CSVD疾病靶点信息输入List 1，红曲作用靶点输入List 2，获取交集靶点信息。

1.1.5 构建红曲“药物-成分-靶点”网络 利用CytoScape 3.7.1软件构建药物红曲“药物-成分-靶点”网络，通过CytoScape 3.7.1软件工具NetworkAnalyzer对网络进行拓扑参数分析，收集主要活性成分及靶点度值（degree）信息。

1.1.6 PPI网络构建 将“1.1.4”项下的交集靶点导入STRING 11.0数据库，限定物种为“Homo sapiens”，置信度区间大于0.4，构建PPI网络。利用CytoScape 3.7.1软件进行参数分析，以大于Degree均值为条件筛选关键靶点。

1.1.7 GO和KEGG富集分析 选择获取的关键靶点导入DAVID 6.8数据库，限定物种为“Homo sapiens”，获取GO、KEGG富集结果并进行可视化分析。

1.2 动物实验

1.2.1 仪器与试药 酶标仪（318MC，美国赛默飞世尔科技公司）；石蜡包埋机（YB-7B，孝感市亚光医用电子技术有限公司）；离心机（LC-4016，安徽中科中佳科学仪器有限公司）；恒温振荡培养箱（BHWY-100BC，常州杰博森仪器有限公司）；红曲（批号：210201，毫州市京皖中药饮片厂），经安徽中医药大学中药资源室鉴定为正品。TNF-α、IL-6、IL-1β试剂盒（睿信生物公司）；尼莫地平（批号：200108，亚宝药业集团股份有限公司）。

1.2.2 动物 SPF级雄性大鼠，体质量 200～230 g[杭州医学院，生产许可证号：SCXK（浙）2019-0002，动物伦理编号：AHUCM-rats-2021051]。

1.2.3 红曲水提液的制备 取红曲原料药，粉碎，过筛，加入药物总量10倍的水煎煮1 h后，过滤并保留滤液，再加入药物总量8倍的水煎煮1 h，过滤并保留滤液；合并两次滤液，旋转蒸发浓缩成3 g·kg－1的提取液备用。

1.2.4 CSVD模型大鼠的复制 健康雄性SD大鼠200～230 g，麻醉后钝性分离右颈总动脉（common carotid artery，CCA）采用丝线于右侧CCA远、近心端进行永久性结扎，距离约1.5 cm左右，结扎完成后缝合皮肤，放回笼中饲养。7 d后永久性结扎左侧CCA，操作步骤同上。假手术组仅分离CCA，不进行结扎操作。大鼠出现癫痫、偏瘫等异常行为则判断模型复制成功。

1.2.5 实验分组与给药 大鼠随机分为6组，每组10只，分别为假手术组、模型组、红曲高剂量组（3 g·kg－1）、红曲中剂量组（1.5 g·kg－1）、红曲低剂量组（0.75 g·kg－1）、尼莫地平组（20 mg·kg－1），按体质量灌胃给药，假手术组、模型组灌胃等量生理盐水，每日一次，连续30 d。

1.2.6 Morris水迷宫实验 水迷宫为黑色圆形水池，等分为4个象限，平台置于象限中。将大鼠面向池壁从4个象限随机选择入水点，记录其在2 min内寻找并爬上平台所需时间，即逃避潜伏期；撤除平台，从平台所在象限对侧选入水点，观察其在2 min内穿越平台次数。实验为期5 d，前4 d用于训练大鼠，第5日进行实验。

1.2.7 海马CA1区病理观察 各组大鼠麻醉后，从胸膛部剪开暴露心脏，用4%多聚甲醛进行灌注，灌注完成后将大鼠断头取脑，随后用石蜡包埋、切片，于显微镜下观察海马CA1区。

1.2.8 指标检测 大鼠麻醉后腹主动脉取血，静置30 min，3000 r·min－1离心10 min，收集上层血清，根据试剂盒说明书进行检测。

1.2.9 Western blot实验 大鼠断头处死，迅速取出海马组织置于冰上，剪碎，按每20 mg组织加入150～250 μL裂解液的比例加入裂解液，匀浆直至完全裂解。裂解后的样品4℃、12 000 r·min－1离心15 min，取上清液，定量后贮存于－80℃冰箱用于蛋白测定，结果用Image J软件进行灰度分析。

1.3 统计分析方法

各组数据用SPSS 23.0软件进行分析，结果用“均数±标准差（±s）”表示，多组间数据采用单因素方差分析，两两比较采用LSD-t检验，P＜0.05或P＜0.01表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 网络药理学预测研究

2.1.1 红曲成分及作用靶点收集 经筛选共获得43种红曲主要成分，包含Monacolin类、红曲色素类、十氢萘衍生物、有机酸等；将红曲成分上传至SwissTargetPrediction数据库预测，去重合并共获得391个潜在作用靶点。

2.1.2 红曲作用靶点及CSVD疾病及预测“Cerebral Small Vessel Disease”作为检索信息输入GeneCards、OMIM、DisGeNET、CTD数据库寻找治疗CSVD疾病的靶点，去重合并后共获得1126个疾病靶点。

2.1.3 交集靶点收集 登入Venny 2.1网站，将1126个CSVD疾病靶点和391个红曲作用靶点信息输入列表，共获得交集靶点91个。

2.1.4 药物-成分-靶点网络 如图1所示，利用CytoScape 3.7.1软件构建“药物-成分-靶点”网络，运用软件内置工具NetworkAnalyzer对网络进行拓扑参数分析，收集活性成分度值（Degree）信息，结果显示Degree值排名靠前的成分有Monacolin K、Monacolin J、Ankaflavin等，提示上述成分可能在红曲治疗CSVD过程中起重要作用。

图1 红曲“药物-成分-靶点”网络图Fig 1 Red yeast rice “drug-component-target” network

2.1.5 PPI网络构建 将交集靶点导入STRING数据库，构建PPI网络，如图2所示。结果显示PPI网络有91个节点，752条边，平均Degree值为16.7，EGFR、MAPK1、ESR1、CLCX8等大于Degree均值关键靶点共计37个，提示这些蛋白可作为红曲治疗CSVD的关键靶点。

图2 PPI网络图Fig 2 Protein-protein interaction network

2.1.6 GO和KEGG富集分析 运用DAVID 6.8数据库进行GO和KEGG分析，GO分析结果涉及171个生物过程，33个细胞组分和51个分子功能，选取排名前10结果绘制条形柱状图，如图3所示；结果表明红曲中的活性成分可能通过参与神经炎症、细胞增殖、信号转导等过程发挥治疗CSVD作用。KEGG分析得到104个通路，选取排名前20通路绘制气泡图，如图4所示。去除与CSVD无关的通路，获得PI3K-Akt信号通路、RAS信号通路等。其中，PI3K-Akt信号通路的count值最大，表示该差异蛋白富集显著性较大。近年来的研究已证实PI3K-Akt信号通路在痴呆类脑血管病中的治疗是通过调节下游靶蛋白mTOR、GSK3β等的活性，介导神经元细胞凋亡、增殖过程，因此选择PI3K-AKT-mTOR通路作为机制研究对象。

图3 GO富集分析Fig 3 GO enrichment analysis

图4 KEGG通路富集分析Fig 4 KEGG pathway enrichment analysis

2.2 动物实验

2.2.1 Morris水迷宫实验 如表1所示，与假手术组比较，模型组大鼠逃避潜伏期显著延长（P＜0.01），撤去平台后穿越平台次数明显减少（P＜0.01），表明模型复制成功；与模型组相比，红曲高、中剂量组及尼莫地平组逃避潜伏期显著减少，穿越平台次数明显增加（P＜0.05或P＜0.01），红曲低剂量组差异无统计学意义。

表1 红曲对CSVD 模型大鼠逃避潜伏期和穿越平台次数的影响( ±s，n＝10)Tab 1 Effect of HQ on the escape latency and the number of crossing platforms in CSVD model rats ( ±s，n＝10)

表1 红曲对CSVD 模型大鼠逃避潜伏期和穿越平台次数的影响( ±s，n＝10)Tab 1 Effect of HQ on the escape latency and the number of crossing platforms in CSVD model rats ( ±s，n＝10)

注：与假手术组比较，##P＜0.01；与模型组比较，*P＜0.05，**P＜0.01。Note：Compared with the sham group，##P＜0.01；compared with the model group，*P＜0.05，**P＜0.01.

组别 剂量 逃避潜伏期/s 穿越平台次数/次假手术组 － 14.37±5.39 8.30±1.42模型组 － 39.92±4.59## 2.10±1.37##红曲高剂量组 3 g·kg－1 24.16±5.29** 5.20±1.40**红曲中剂量组 1.5 g·kg－1 29.86±4.81** 4.50±1.96*红曲低剂量组 0.75 g·kg－1 37.27±7.80 2.70±1.55尼莫地平组 20 mg·kg－1 23.96±4.98** 5.40±1.80**

2.2.2 大鼠海马组织病理 如图5所示，假手术组大鼠海马CA1区细胞排列整齐，形态完整，可明显观察到核仁和胞浆；与假手术组相比，模型组大鼠海马CA1区细胞排列松散，细胞较为稀疏，细胞多呈不规则形，核仁和胞浆界限不清晰，提示造模成功；与模型组相比，红曲各剂量组及尼莫地平组大鼠海马CA1区细胞排列趋于规则、紧密，病变程度均有明显改善，表明红曲对CSVD模型大鼠的海马组织具有一定的保护作用。

图5 CSVD模型大鼠海马CA1区HE染色（×200）Fig 5 HE staining of CA1 area of hippocampus in CSVD model rats（×200）

2.2.3 指标测定 如表2所示，与假手术组相比，模型组大鼠血清中TNF-α、IL-6、IL-1β含量显著增高（P＜0.01）；与模型组相比，红曲高、中剂量组及尼莫地平组大鼠血清中TNF-α、IL-6、IL-1β含量显著降低（P＜0.05或P＜0.01），红曲低剂量组大鼠血清中TNF-α、IL-1β水平显著降低（P＜0.05），IL-6水平无统计学意义。表明红曲能显著降低CSVD大鼠血清中炎症因子水平，显示出红曲具有良好的抗炎作用。

表2 红曲对CSVD大鼠血清中TNF-α、IL-6、IL-1β炎症因子的影响( ±s，n＝10)Tab 2 Effect of HQ on TNF-α，IL-6 and IL-1β inflammatory factors in serum of CSVD rats ( ±s，n＝10)

表2 红曲对CSVD大鼠血清中TNF-α、IL-6、IL-1β炎症因子的影响( ±s，n＝10)Tab 2 Effect of HQ on TNF-α，IL-6 and IL-1β inflammatory factors in serum of CSVD rats ( ±s，n＝10)

注：与假手术组比较，##P＜0.01；与模型组比较，*P＜0.05，**P＜0.01。Note：Compared with the sham group，##P＜0.01；compared with the model group，*P＜0.05，**P＜0.01.

组别 TNF-α/（ng·L－1）IL-6/（ng·L－1）IL-1β/（ng·L－1）假手术组 312.58±24.79 46.32±6.27 28.71±7.62模型组 491.52±39.89## 70.23±12.37## 42.37±4.36##红曲高剂量组 372.62±45.59** 54.41±10.77** 30.44±6.23**红曲中剂量组 394.23±20.35* 62.32±13.27** 32.25±5.27*红曲低剂量组 412.61±49.58* 68.45±5.86 34.36±5.86*尼莫地平组 336.65±25.95** 50.37±10.68** 31.25±4.68**

2.2.4 Western blot实验 蛋白电泳结果如图6所示。结果显示，与假手术组比较，模型组大鼠海马区PI3K、Akt、mTOR蛋白表达水平均显著降低（P＜0.01）；与模型组比较，红曲高、中剂量组及尼莫地平组PI3K、Akt、mTOR蛋白表达水平显著升高（P＜0.01），红曲低剂量组PI3K、mTOR表达水平显著升高（P＜0.05），Akt蛋白表达水平差异无统计学意义。结果表明红曲可通过调节PI3KAKT-mTOR通路，调控神经细胞增值、凋亡过程，发挥对于CSVD模型大鼠的治疗作用。

图6 各组大鼠海马区PI3K，Akt，mTOR蛋白表达水平图（ ±s，n＝3）Fig 6 Expression levels of PI3K，Akt and mTOR protein in the hippocampus of each group of rats（ ±s，n＝3）

3 讨论

CSVD是临床常见的脑血管疾病，与高血脂、高血压等危险因素关系密切[9]。中医理论尚未明确定义CSVD，通常认为其属于络病，病位在脑，由浊邪入血，入髓伤髓所致[10]。临床治疗CSVD应以活血化瘀、化浊益髓的中药为主[11]。红曲具有活血化瘀、健脾消食的功效，临床上常用的中成药血脂康、脂必妥均以红曲为主要成分，广泛用于治疗高血脂、动脉粥样硬化、心脑血管病等[12-14]，可作为治疗CSVD的潜在药物。

本研究运用网络药理学方法筛选获得Monacolin K、Ankaflavin、GABA等43个红曲活性成分，PIK3CA、MTOR、MAPK1等1126个脑小血管病靶点；PPI网络分析共发现91个节点，752条边，平均Degree值为16.7，获得EGFR、MAPK1、ESR1等37个关键靶点；GO分析结果涉及171个生物过程、33个细胞组分、51个分子功能，主要涉及神经炎症、信号转导、细胞增殖等。研究表明，神经炎症在脑血管疾病的发展中起重要作用，降低相关炎症因子如TNF-α、IL-6、IL-1β等水平，可改善血脑屏障通透性，减轻脑组织损伤，促使大脑结构功能恢复正常[15-16]。KEGG分析结果得到104个通路，主要有PI3K-Akt、Rap1、RAS通路等，PI3K-Akt通路研究较为广泛，其在脑卒中、血管性痴呆等疾病的治疗中起着重要作用。Qi等[17]研究发现3-丁基苯酞（NBP）能通过激活PI3K/Akt信号通路抑制CSVD大鼠神经细胞凋亡，恢复细胞基本功能，提高大鼠学习记忆能力。Chen等[18]研究表明人参皂苷Rg1可通过PI3K/Akt/mTOR信号通路增加缺血性卒中后血管内皮生长因子的表达，促进脑内血管生成，改善脑血流量。

本研究选择不同剂量红曲干预CSVD模型大鼠，探究其作用机制，对网络药理学研究结果进行验证。Morris水迷宫实验结果显示，红曲能显著缩短CSVD大鼠的逃避潜伏期，增加穿越平台次数，表明红曲显著改善CSVD模型大鼠的短期学习记忆能力；HE病理切片结果显示红曲治疗组大鼠海马CA1区细胞形态完整、排列整齐，核仁和胞浆界限清晰，不同剂量红曲治疗组海马CA1区病变程度均有明显改善，高、中剂量效果较为明显；网络药理学GO分析结果表明，红曲治疗CSVD可能与神经炎症、细胞增殖、信号转导等生物过程相关，其中神经炎症在CSVD发展过程起重要作用。生化指标结果显示，不同剂量红曲治疗组可显著降低CSVD模型大鼠血清TNF-α、IL-6、IL-1β炎症因子水平，其效果呈剂量依赖性；网络药理学研究结果显示红曲中Monacolin类、红曲色素等为其活性成分，本研究结果中红曲能显著降低TNF-α、IL-6、IL-1β水平可能与上述成分有关。KEGG分析结果显示，涉及CSVD的有PI3K-Akt、RAS、Rap1信号通路等。研究表明PI3K-Akt信号通路可通过调节下游靶蛋白mTOR活性，参与自噬清除β淀粉样蛋白的沉积、恢复细胞功能等发挥神经保护作用[17-18]；Western blot结果表明，与假手术组相比，模型组PI3K、AKT、mTOR蛋白水平显著降低；与模型组相比，红曲治疗组可不同程度增加PI3K、AKT、mTOR蛋白水平，提示红曲可通过上调PI3K/AKT/mTOR蛋白的表达，参与调控神经元细胞增殖、分化、凋亡等发挥治疗CSVD的作用。

综上，通过网络药理学和分子对接，构建红曲治疗CSVD的成分、疾病、作用靶点、相关通路之间的复杂网络关系，展现了中药多成分、多靶点、多途径的治疗优势。通过Morris水迷宫，海马组织HE染色，TNF-α、IL-6、IL-1β炎症因子检测，PI3K、AKT、mTOR蛋白测定等实验验证网络药理学预测结果，初步揭示了红曲治疗CSVD的药效机制，可为后期深入探究其治疗CSVD机制提供理论依据。